劉效筠，靳　怡

(1.湖北省黃石市中心醫(yī)院,黃石　435000；　2.湖北省黃石市疾病控制中心，黃石　435000)

環(huán)磷酰胺(CPP)為氮芥與磷酰胺基結(jié)合而成的化合物，是臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑，可用于治療各種自身免疫性疾病，即能抑制細胞增殖，非特異性殺傷抗原敏感性小淋巴細胞，限制其轉(zhuǎn)化為免疫母細胞。

臨床運用中發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺具有較大的毒副作用，如有明顯的胃腸道反應(yīng)；大劑量使用可導致血小板減少，甚至貧血；高濃度使用時，易造成出血性膀胱炎；抑制卵細胞發(fā)育，影響生育。遺傳毒理學研究表明，環(huán)磷酰胺對人體遺傳物質(zhì)具有很強的致突變性，常導致染色體的結(jié)構(gòu)畸變。因此，在我國的中草藥資源中積極尋求和使用環(huán)磷酰胺誘變藥物或藥物活性成分，減少環(huán)磷酰胺的毒性，并提高其用藥安全是非常重要的。

姜黃素(curcumin)是從姜黃的根莖中提取的一種天然有效成分，屬多酚類化合物，結(jié)晶狀粉末，呈橙黃色。分子式為C21H20O6，相對分子質(zhì)量為368.39。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和抗突變等廣泛的藥理作用，是當今國際上重點研究的天然成分之一[1,2]。

1　材料與方法

1.1試驗儀器和材料

1.1.1受試藥物姜黃素(分析純浙江省溫州市東升化工試劑廠，批號20110613)；注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號20111022)。

1.1.2實驗動物昆明種白色小鼠清潔級40只，體重20～25 g，雌雄各半，湖北中醫(yī)藥大學提供。

1.1.3主要儀器與器材普通光學顯微(9SE-Z型日本NIKON 公司);數(shù)碼相機(IXUS-60型日本CANON 公司。

1.1.4主要試劑甲醇(methanol)，吉姆薩染料(Giemsa stain)，酸緩沖液(phosphate buffer solution)。

1.2方法

1.2.1分組及給藥方法

1.2.1.1姜黃素混懸液的配制 姜黃素易溶于有機溶劑，而在水中的溶解度很低，本實驗利用淀粉混懸液加入姜黃素進行充分混勻配制成姜黃素淀粉混懸液。

1.2.1.2分組情況 將40只小鼠平均分五組，分別為CPP組、高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白組，每組各有8只小鼠。

1.2.1.3給藥方法高劑量組200 μg/g·d-1、中劑量組100 μg/g·d-1、低劑量組50 μg/g·d-1，按各組劑量要求，以不同濃度姜黃素淀粉混懸液給小鼠連續(xù)灌胃6 d，1次/d，0.5 ml/次；空白對照組與陽性對照組灌服等量的淀粉混懸液。于第6 d灌胃后，CPP組與高、中、低三個劑量組小鼠腹腔注射濃度為0.4 mg/ml的環(huán)磷酰胺1 ml，空白對照組注射生理鹽水1 ml。

1.2.2微核標本的制備采用涂片法制備小鼠外周血正染紅細胞的微核標本，事先準備好80片用玻璃筆刻制有組別標記的載玻片。①取材：分別于注射環(huán)磷酰胺24 h與48 h后，用剪刀剪去小鼠尾部末端1 mm。②制片：將尾血擠出，滴在載玻片上，然后推片約3～5 cm。③固定：涂片自然干燥后，放在甲醇中固定10 min。④染色：干燥后的涂片用Giemsa工作液(1份吉姆薩原液與9份磷酸緩沖液混勻，pH為7.2)染色5～10 min，清水沖洗，晾干并保存。

1.2.3微核的計數(shù)與觀察用雙盲法閱片，選擇分布均勻，染色較好的區(qū)域，在油鏡下計數(shù)小鼠正染紅細胞微核。使用數(shù)碼相機的典型標本顯微攝影記錄來拍攝標本。觀察小鼠外周血微核標本為小鼠正染紅細胞的微核。用吉姆薩染液染色后，正染紅細胞呈橙黃色。典型的微核為紫色或紫紅色，大小是紅色的血細胞直徑的1/20～1/3。邊緣光滑整齊，圓形，單一，嗜色性和核質(zhì)相同。以1000為每只動物選取的總細胞計數(shù)數(shù)，觀察并記錄細胞中含有的微核數(shù)，用千分率來表示微核率。微核率=含微核的正染紅細胞數(shù)/觀察的正染紅細胞數(shù)×1000‰。

1.2.4統(tǒng)計學處理 各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，各劑量組間的比較用方差分析，對微核率進行直線相關(guān)性分析。利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。以P<0.05為差異有顯著意義。

2　結(jié)果

24 h與48 h小鼠外周血正染紅細胞MN實驗結(jié)果見表1。

表1　24 h與48 h小鼠外周血正染紅細胞MN實驗結(jié)果

注：CPP組、高劑量組、中劑量組和低劑量組與空白組比較，*P<0.05；48h與24h比較，△P<0.05

3　討論

微核(MCN)是指位于細胞漿中獨立于主核的核小體,主要由外界損害因素作用細胞后,導致細胞染色體丟失或斷裂,從而在胞漿中形成1 個或數(shù)個小核[3]。因此在染色體遺傳性疾病和癌癥的早期診斷等方面，微核試驗是一種理想的方法。 環(huán)磷酰胺具有較大的毒副作用，遺傳毒理學研究表明，環(huán)磷酰胺對人體遺傳物質(zhì)具有很強的致突變性，常導致染色體的結(jié)構(gòu)畸變。已經(jīng)研究確認，環(huán)磷酰胺能夠誘導細胞產(chǎn)生微核，這是在染色體畸變情況下產(chǎn)生的效果。

對細胞進行計數(shù)顯示用0.4 mg/ml環(huán)磷酰胺處理24 h后，CPP組的小鼠正染紅細胞微核率為(9.83±0.28)‰，而姜黃素低劑量組降低至(8.13±0.31)‰，姜黃素中劑量組降低至(6.24±0.24)‰，姜黃素高劑量組降低至(4.39±0.21)‰，由此可見，在不同濃度梯度的姜黃素組中，可以明顯地觀察到姜黃素劑量越高，其相應(yīng)分組的微核率越低。將對照組與CPP組對比顯示，CPP組細胞經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導后微核率明顯高于對照組。同理分析48 h數(shù)據(jù)亦可發(fā)現(xiàn)相同量效關(guān)系。比較24 h與48 h實驗數(shù)據(jù)，隨著時間推移， 48 h各組微核率橫向比較均高于24 h。本實驗結(jié)果證實，姜黃素對CPP誘導小鼠正染紅細胞微核的產(chǎn)生有抑制作用，且抑制作用與姜黃素的濃度梯度成正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠拮抗環(huán)磷酰胺誘導小鼠正染紅細胞微核的產(chǎn)生，減少環(huán)磷酰胺的遺傳物質(zhì)致突變性及毒性，并能輔助提高環(huán)磷酰胺的臨床用藥安全。

1MIGUEL LOPEZ-LAZARO. Anticancer and carcinogenic properties of curcumin:Considerations for its clinical developmeng as a cancer chemopreventive and chemotherapeutic agent[J].Mol Nutr Food Res,2008,52：103

2MAHESHWARI R K,SINGH A K,GADDIPATI J,etal.Multiple biologicl activities of curcumin:A short review[J].Life Sciences,2006,78(18)：2081

3曹佳,林真,余爭平.微核試驗——原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性評價中的應(yīng)用[M]. 北京:軍事醫(yī)學科學出版社,2000 :1-9