黃偉 張樂(lè)鳴 張怡 陳瑩

血漿miR-145在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

黃偉 張樂(lè)鳴 張怡 陳瑩

目的 研究miR-145在結(jié)直腸癌患者和健康者血漿中的表達(dá)差異，并探討其與臨床特征之間的關(guān)系。 方法 收集53例初治結(jié)直腸癌患者和26例健康者外周血漿，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá)情況，分析其與臨床特征之間的關(guān)系，評(píng)估其對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能。 結(jié)果 miR-145在結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)較健康者顯著降低（P＜0.01），miR-145的AUC為0.859，鑒別結(jié)直腸癌患者的敏感性86.8%、特異性88.5%，但miR-145的表達(dá)水平與臨床特征（性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期、局部浸潤(rùn)深度及CEA水平）之間均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。 結(jié)論 血漿miR-145有望作為結(jié)直腸癌的新型標(biāo)記物，但可能只參與了結(jié)直腸癌發(fā)生的起始過(guò)程。

miRNA miR-145 結(jié)直腸癌 血漿

miRNA miR-145 Colorectal cancerPlasma

結(jié)直腸癌是人類(lèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。因其早期癥狀不典型，臨床缺乏有效的早期篩查方法，而腸鏡等侵入性檢查又降低了患者的依從性，大多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期。因此，需要建立一個(gè)簡(jiǎn)單、實(shí)用的早期篩查方法。MicroRNAs（miRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸，單鏈、內(nèi)源性、高度保守的非編碼小分子RNA[1]。多項(xiàng)研究結(jié)果[2-4]顯示，miRNAs具有調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖及凋亡等作用，并作為腫瘤性miRNAs（oncomiRs）或腫瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）參與腫瘤的形成與演變，已被證實(shí)有潛力作為多種惡性腫瘤新型標(biāo)記物。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者及健康體檢者血漿中miR-145的表達(dá)水平，并分析與患者臨床特征之間的關(guān)系，探討其在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集寧波市第一醫(yī)院2011-08—11的53例結(jié)直腸癌患者的血漿標(biāo)本。53例均為腺癌，其中結(jié)腸癌17例，直腸癌36例。女15例，男38例，年齡28～80歲，中位年齡58歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者33例，陰性者20例。按照最新結(jié)直腸癌TNM分期，I期6例、Ⅱ期14例、Ⅲ期27例、Ⅳ期6例。另選取26例年齡、性別匹配的健康體檢者作為正常對(duì)照組，血清CEA、CA19-9及腹部CT均未見(jiàn)異常，無(wú)腫瘤病史。所有入組患者手術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療及化療，且無(wú)合并癥。在采集標(biāo)本前均征得本人同意，并簽署知情同意書(shū)，按2009年由國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）聯(lián)合制定的腸癌TNM分期法對(duì)結(jié)直腸癌病例進(jìn)行病理學(xué)分型，以病理學(xué)診斷作為最終診斷。

1.2 標(biāo)本處理和RNA提取 用EDTA管采集外周靜脈血5ml，常溫下4h內(nèi)進(jìn)行處理。血標(biāo)本在4℃下1 200g離心10min，取上層血漿再在4℃下12 000g離心10min，再取上層血漿-80℃冰箱保存?？俁NA提?。喝?80℃冰箱保存的血漿標(biāo)本400μl，采用美國(guó)Ambion公司生產(chǎn)的mirVana PARIS Kit，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及OD260/ OD280比值，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 miRNA的cDNA合成 采用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，反應(yīng)條件為：37℃60min，95℃5min。反應(yīng)結(jié)束后，合成的cDNA-20℃保存。

1.4 miRNA的熒光定量檢測(cè) 采用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，所有反應(yīng)采用2復(fù)孔。25μl的反應(yīng)體系：2.5μl的 cDNA，12.5μl的 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，5.0μl的 RNase-free water，2.5μl的10×miScript Universal Primer，2.5μl的miRNAs特異前向引物，miR-145及U6的引物由上海捷瑞公司合成，miR-145引物序列為5′-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3′U6為5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′。反應(yīng)條件為：95℃15min，接著94℃15s，55℃30s，70℃34s，45個(gè)循環(huán)。采用ABI step-one plus實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，Ct值用SDS2.1軟件計(jì)算。檢測(cè)miRNA的相對(duì)表達(dá)定量時(shí)，以U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果分析，將不同樣本的相對(duì)表達(dá)定量值（relative quantity，RQ）進(jìn)行比較。RQ=2-△△Ct，△△Ct=待測(cè)標(biāo)本的△Ct-對(duì)照樣本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，miRNAs相對(duì)表達(dá)量呈偏態(tài)分布、方差不齊，以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示；兩組間或多組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Kruskall-Wallis檢驗(yàn)；應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者與健康體檢者血漿中miR-145的表達(dá) miR-145及U6的Realtime PCR擴(kuò)增曲線均呈“S”型；PCR產(chǎn)物熔解曲線均為單峰，說(shuō)明擴(kuò)增的目的基因特異性好且結(jié)果可靠，見(jiàn)圖1。

圖1 Realtime PCR檢測(cè)患者與健康體檢查血漿中miR-145的表達(dá)（A：部分樣本的U6及miR-145擴(kuò)增曲線；B：U6熔解曲線；C：miR-145熔解曲線）

以U6為內(nèi)參，結(jié)直腸癌患者血漿中miR-145的RQ為0.407（0.244，0.912）；健康體檢者血漿中RQ為1.512（1.386，1.713）。采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.2 血漿miR-145在結(jié)直腸癌中的診斷效能 根據(jù)ROC曲線分析，血漿miR-145的AUC為0.859（95%CI: 0.772～0.947），在最佳截?cái)嘀?.0568，血漿miR-145的敏感性為86.8%，特異性為88.5%，見(jiàn)圖3。

2.3 血漿miR-145的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床特征之間的關(guān)系 血漿miR-145的RQ與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期、局部浸潤(rùn)程度及血清CEA水平無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05），見(jiàn)表1。但在不同TNM分期的患者血漿miR-145的RQ與健康對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），然而其表達(dá)量未顯示出隨著TNM分期的增加而降低的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4。

3 討論

提高癌癥早期階段的檢出率能顯著提高患者生存率，降低癌癥病死率及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。目前的新型早期篩查方法主要是對(duì)腫瘤標(biāo)記物的尋找，標(biāo)本主要是血液、尿液、胸腹水等體液，相比傳統(tǒng)的組織標(biāo)本來(lái)源更易獲得，對(duì)患者的創(chuàng)傷更小。自從Mitchell等[2]首次證實(shí)血漿中miRNA能鑒別出前列腺癌患者后，循環(huán)miRNA作為新型腫瘤標(biāo)記物成為研究的熱點(diǎn)。最近，Allen等[6]研究發(fā)現(xiàn)血漿中miRNAs性質(zhì)非常穩(wěn)定，即便在100℃煮沸10min或室溫下放置不同的時(shí)間（4、12、24h）或反復(fù)凍融，其表達(dá)水平基本不變，這為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。隨后在乳腺癌[7]、胃癌[8]、胰腺癌[9]、肝癌[10]及肺癌[11]等惡性腫瘤患者的血漿中發(fā)現(xiàn)：miRNAs異常的表達(dá)與組織病理學(xué)特征以及疾病的不同階段之間有著密切的關(guān)系。目前Slaby等[12]、Wang等[13]及龔等[14]研究結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中miR-145的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn):miR-145在結(jié)直腸癌組織中均顯著低表達(dá)（均P＜0.01），但表達(dá)水平是否與臨床特征有關(guān)尚有爭(zhēng)議，而結(jié)直腸癌患者血漿中miR-145的表達(dá)情況則缺乏相關(guān)研究；另外Wang等[13]報(bào)道：miR-143只在結(jié)腸癌中表達(dá)降低，考慮到本研究中大多數(shù)研究對(duì)象是直腸癌患者（36/53），故選擇了miR-145來(lái)研究血漿miRNAs作為結(jié)直腸癌非侵入性標(biāo)記物的價(jià)值。

圖2 結(jié)直腸癌患者及健康體檢者血漿中miR-145的RQ（圖中數(shù)字代表該組數(shù)據(jù)中變異較大的標(biāo)本）

圖3 miR-145的ROC曲線

圖4 不同TNM分期結(jié)直腸癌患者和健康體檢者的血漿miR-145的RQ（圖中數(shù)字代表該組數(shù)據(jù)中變異較大的標(biāo)本）

表1 血漿miR-145的RQ與患者臨床特征之間的關(guān)系

miR-145在鼠的心臟中首次被發(fā)現(xiàn)[15]，基因編碼位于染色體5q32上，后Michael等[16]證實(shí)miR-145基因存在于人類(lèi)同樣染色體位置，但是人類(lèi)染色體5q31是一個(gè)脆性位點(diǎn)，與染色體5q32相距很近，該位點(diǎn)基因突變或缺失容易導(dǎo)致miR-145的缺失或下調(diào)，這可能是導(dǎo)致腺瘤和結(jié)直腸癌組織中miR-145表達(dá)水平顯著降低的原因之一。其他研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-145不僅在多種腫瘤組織中下調(diào)，還在多種腫瘤細(xì)胞株中下調(diào)，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)增、侵襲及轉(zhuǎn)移有抑制作用。但是miR-145在各種腫瘤患者的體液（包括血液、尿液、胸腹水、唾液等）中的研究仍然缺乏，這將是今后研究的新領(lǐng)域。本研究中，miR-145在結(jié)直腸癌患者血漿中表達(dá)量相比健康對(duì)照組顯著降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是其表達(dá)水平與臨床特征如性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤TNM分期、局部浸潤(rùn)深度及血清CEA水平均無(wú)相關(guān)性，這與Slaby等[12]和Wang等[13]報(bào)道m(xù)iR-145的低表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的臨床特征之間無(wú)關(guān)相符合，提示miR-145可能僅在結(jié)直腸癌發(fā)生的起始階段發(fā)揮作用，但矛盾的是龔文容等[14]報(bào)道m(xù)iR-145的低表達(dá)水平與腫瘤的分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或浸潤(rùn)生長(zhǎng)密切相關(guān)。這可能與標(biāo)本量小及標(biāo)本來(lái)源的不同有關(guān)。另外有研究表明[18]miR-145對(duì)黏蛋白（Mucin-1）的作用減弱或消失將促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Gregersen等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-145能夠通過(guò)識(shí)別YES基因和轉(zhuǎn)錄因子STAT1來(lái)發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能。Sachdeva等[20]通過(guò)調(diào)節(jié)抑癌基因p53對(duì)miR-145的誘導(dǎo)來(lái)發(fā)揮對(duì)促癌基因c-Myc的抑制作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。上述研究結(jié)果表明miR-145可能通過(guò)突變、缺失、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子或致癌基因等機(jī)制來(lái)發(fā)揮腫瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）的作用，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

糞便隱血試驗(yàn)、血清CEA檢測(cè)及腸鏡仍是目前臨床上發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的常用手段，但腸鏡屬于侵入性操作，其他檢查敏感性及特異性低[21]，致使臨床上結(jié)直腸癌的早期檢出率仍然偏低。本研究中ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)：血漿miR-145的AUC為0.859（95%CI:0.772～0.947），鑒別結(jié)直腸癌患者的敏感性為 86.8%、特異性為88.5%，說(shuō)明血漿miR-145對(duì)結(jié)直腸癌有較準(zhǔn)確的診斷價(jià)值，相比腸鏡、組織病理取材等侵入性檢查具有創(chuàng)傷小、取材方便、患者依從性好等優(yōu)勢(shì)，有望用于結(jié)直腸癌的早期篩查和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。如果進(jìn)一步研究更大樣本量的miR-145表達(dá)水平及臨床意義，結(jié)合Ng等[3]和Huang等[4]發(fā)現(xiàn)的miR-92a和miR-29a，有望建立結(jié)直腸癌的miRNAs聯(lián)合診斷模型，使血漿miRNAs成為結(jié)直腸癌常規(guī)臨床診斷的非侵入性標(biāo)記物。

[1]Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V,et al.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[2]Mitchell P S,Parkin R K,Kroh E M,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer.detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[3]Ng E K,Chong W W,Jin H,et al.Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer:a potential marker for colorectal cancer screening[J].Gut,2009,58(10): 1375-1381.

[4]Huang Z,Huang D,Ni S,et al.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].Int J Cancer,2010,127(1):118-126.

[5]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[6]Ho A S,Huang X,Cao H B,et al.Circulating miR-210 as a novel hypoxia marker in pancreatic cancer[J].Transl Oncol,2010,3(2): 109-113.

[7]Heneghan H M,Miller N,Lowery A J,et al.circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer[J].Ann Surg,2010,251(3):499-505.

[8]Tsujiural M,Ichikawa D,Komatsu S,et al.Circulating microRNAs in plasma of patients with gastric cancers[J].Brit J Cancer,2010, 102(7):1174-1179.

[9]Morimura R,Komatsu S,Ichikawa D,et al.Novel diagnostic value of circulating miR-18a in plasma of patients with pancreatic cancer[J].Brit J Cancer,2011,105（11）:1733-1740.

[10]Zhou J,Yu L,Gao X,et al.Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J].J Clin Oncol,2011,29(36):4781-4788.

[11]Zheng D L,Haddadin S,Wang Y,et al.Plasma microRNAs as novel biomarkers for early detection of lung cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2011,4(6):575-586.

[12]Slaby O,Svoboda M,Fabian P,et al.Altered Expression of miR-21,miR-31,miR-143 and miR-145 Is Related to Clinicopathologic Features of Colorectal Cancer[J].Oncology,2007,72 (6):397-402.

[13]Wang C J,Zhou Z G,Wang L,et al.Clinicopathological significance of microRNA-31,-143 and-145 expression in colorectal cancer[J].Dis Markers,2009,26(1):27-34.

[14]龔文容,盧曉明,陳志松,等.miR-145在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)及臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(1):35-36.

[15]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9): 735-739.

[16]Michael M Z,SM O C,van Holst Pellekaan N G,et al.Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia[J]. Mol Cancer Res,2003,1(12):882-891.

[17]Sachdeva M,Mo Y Y.miR-145-mediated suppression of cell growth,invasion and metastasis[J].Am J Transl Res,2010,2(1): 170-180.

[18]Sachdeva M,Mo Y Y.MicroRNA-145 suppresses cell invasion andmetastasisbydirectlytargetingmucin1[J].CancerRes,2010,70(1):378-387.

[19]Gregersen L H,Jacobsen A B,Frankel L B,et al.MicroRNA-145 Targets YES and STAT1 in Colon Cancer Cells[J].PLoS ONE, 2010,5(1):e8836-8845.

[20]Sachdevaa M,Zhu S M,Wu F T,et al.p53 represses c-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145[J].PNAS, 2009,106(9):3207-3212.

[21]Duffy M J.Carcinoembryonic Antigen as a Marker for Colorectal Cancer:Is It Clinically Useful?[J].Clin Chem,2001,47(4): 624-630.

2012-08-30）

（本文編輯：胥昀）

315000 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（黃偉，碩士研究生）；寧波市第一醫(yī)院腫瘤外科（張樂(lè)鳴），重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張怡、陳瑩）

張樂(lè)鳴，E-mail：zlm.nb@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the plasma expression of miR-145 in patients with colorectal cancer and its clinical significance. Methods The plasma levels of miR-145 in 53 patients with colorectal cancer and 26 healthy subjects were measured using real-time quantitative PCR.The relationship between miR-145 expression and clinical characteristics of colorectal cancer was analyzed.The diagnostic value of miR-145 for colorectal cancer was evaluated.Results The plasma miR-145 levels were decreased significantly in colorectal cancer patients（P＜0.01）.The AUC (the area under the ROC curve)of miR-145 was 0.859 with a 86.8%sensitivity and 88.5%specificity in discriminating colorectal cancer from normal subjects;however,the expression levels of miR-145 were not associated with the gender,age,tumor location,nodal status,TNM staging,T-classification and CEA levels of patients (P＞0.05). Conclusion A decreased plasma miR-145 levels are detected in patients with colorectal cancer,which suggests miR-145 might be used as a potential tumor-marker for colorectal cancer.