黃理福 王小紅 張顯軍 柯莽 朱汝健 俞洪元 林愛芬 王天濟(jì)

膀胱移行細(xì)胞癌患者人類白細(xì)胞抗原G的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

黃理福 王小紅 張顯軍 柯莽 朱汝健 俞洪元 林愛芬 王天濟(jì)

目的 探討膀胱移行細(xì)胞癌組織中人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法選取62例膀胱移行細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本組織，另取術(shù)中癌旁正常膀胱黏膜組織標(biāo)本作為對照，采用免疫組織化學(xué)Envision方法檢測兩種組織中HLA-G的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果62例膀胱移行細(xì)胞癌患者中43例（69.4%）HLA-G陽性表達(dá)，20例癌旁正常膀胱黏膜組織中均未見HLA-G陽性表達(dá)。HLA-G的表達(dá)水平與膀胱移行細(xì)胞癌患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、臨床分期、組織學(xué)分級均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)論膀胱移行細(xì)胞癌組織中HLA-G表達(dá)上調(diào)，HLA-G高表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞臨床病理特征無關(guān)。

膀胱癌 疫組織化學(xué) HLA-G

目前，我國膀胱癌發(fā)病率呈逐年上升和年輕化的趨勢，其中膀胱移行細(xì)胞癌是最為常見的泌尿系惡性腫瘤，病因尚不清楚[1]。隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤能逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視密切相關(guān)[2]。其機(jī)制之一是通過上調(diào)人類白細(xì)胞抗原-G（HLAG）的表達(dá)[3]，HLA-G屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類抗原分子（HLA-Ⅰb），是一種重要的免疫耐受分子，能夠抑制NK細(xì)胞和T細(xì)胞的功能，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本研究利用免疫組織化學(xué)Envision方法，從蛋白水平對HLA-G的表達(dá)及其與膀胱移行細(xì)胞癌的臨床特征間的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2004—2008年臺州醫(yī)院的膀胱移行細(xì)胞癌開放手術(shù)切除標(biāo)本62例，其中男53例，女9例；年齡43～83歲，平均69歲；＜60歲34例，≥60歲28例。按WHO 1973病理分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級6例，Ⅱ級30例，Ⅲ級26例。按UICC 2002年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：Ta～T1期35例；T2～T4期27例。另取20例癌旁膀胱黏膜組織作為對照，均取自手術(shù)切緣，距腫瘤邊緣5cm以上，術(shù)后病理檢查證實(shí)為正常膀胱黏膜。所有患者均為初次手術(shù)，術(shù)前均未接受化、放療和免疫治療。

1.2 主要試劑 鼠抗人HLA-G單克隆抗體4H84購自EXBIO公司；ChemMateTMEnvision+/HRP，兔/小鼠（二抗）購自上海Gene Tech有限公司。

1.3 方法 采用免疫組化 Envision Systems法，抗HLA-G單克隆抗體工作濃度為1∶500。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以PBS代替一抗作為陰性對照，以妊娠6周人工流產(chǎn)的滋養(yǎng)層細(xì)胞組織切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為陽性特征。每例標(biāo)本隨機(jī)選擇10個高倍視野（×400），計算陽性染色的細(xì)胞數(shù)取平均值。由2位病理醫(yī)師對結(jié)果進(jìn)行評分。參考細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分。按染色強(qiáng)度不同：無顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例積分：＜30%細(xì)胞染色為0分，30%～50%細(xì)胞染色為1分，50%～75%細(xì)胞染色為2分，＞75%細(xì)胞染色為3分。每例標(biāo)本的積分為（染色強(qiáng)度+陽性細(xì)胞比例)/2，按積分的高低分為：0分為陰性（-），0.5～1分為弱陽性（+），1.5～2分為中等陽性（++），2.5～3分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 膀胱移行細(xì)胞癌與癌旁正常黏膜組織中HLA-G的表達(dá)情況 62例膀胱移行細(xì)胞癌患者中 43例（69.4%）HLA-G陽性表達(dá)，20例癌旁正常膀胱黏膜組織中均未見HLA-G陽性表達(dá)。兩種組織中HLA-G的表達(dá)情況見圖1-2。

圖1 癌旁正常膀胱黏膜組織中HLA-G呈陰性表達(dá)

圖2 膀胱移行細(xì)胞癌HLA-G呈陽性表達(dá)，在光鏡下可見癌細(xì)胞漿和/或膜上出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色均質(zhì)狀或顆粒狀

2.2 膀胱移行細(xì)胞癌中HLA-G的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系 62例患者中HLA-G表達(dá)-、+、++、+++者分別為19、13、20、10例，HLA-G的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見表1。

由表1可見，HLA-G的表達(dá)水平與膀胱移行細(xì)胞癌患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、臨床分期及分化程度均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。

表1 膀胱移行細(xì)胞癌中HLA-G的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系（例）

3 討論

HLA-G屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰb，HLA-G mRNA共編碼7種亞型的蛋白質(zhì)分子，包括4種膜結(jié)合型（mHLA-G，即G1、G2、G3、G4，分別缺乏外顯子7，外顯子7和3，外顯子7、3、4，外顯子7、4）和3種可溶型HLA-G（sHLA-G，即G5、G6、G7）[4]。最早發(fā)現(xiàn)HLA-G的表達(dá)僅局限于母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞，在母胎耐受中發(fā)揮作用。近年來，隨著檢測水平的提高，不僅在人類胚胎的許多器官檢測到HLA-G的表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)其在人類黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌、食管癌等許多惡性腫瘤的表達(dá)上調(diào)[5-9]。

研究表明，HLA-G誘導(dǎo)的免疫抑制可能是腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫應(yīng)答的重要策略之一[10]。其免疫抑制的作用機(jī)制包括下列幾方面：（1）HLA-G蛋白能直接通過與殺傷抑制受體（KIR）結(jié)合，抑制NK細(xì)胞活性，使HLAG陽性的靶細(xì)胞免受NK細(xì)胞的裂解。HLA-G也可通過使細(xì)胞表面表達(dá)另一種HLA Ib類分子HLA-E這一間接途徑發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)。（2）HLA-G通過與KIR受體的相互作用，抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的凋亡，抑制其細(xì)胞毒作用[11]。（3）HLA-G蛋白通過KIR受體與抗原遞呈細(xì)胞作用，抑制這些細(xì)胞的抗原提呈和分泌細(xì)胞因子的功能，從而降低其對機(jī)體免疫反應(yīng)的刺激,抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[12]。（4）可溶型HLA-G（sHLA-G）還可以通過與CD8分子結(jié)合，上調(diào)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá)及可溶型FasL的分泌，激發(fā)Fas/ FasL途徑誘導(dǎo)活化的CD8+Fas+的T細(xì)胞和NK細(xì)胞凋亡[13]，并通過一個反饋機(jī)制抑制分泌sHLA-G的CD4+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。（5）HLA-G復(fù)合體的活性可以由CD25-、FOX3-等系類物質(zhì)進(jìn)一步加強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)HLAG陽性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖減退及免疫抑制作用[14]。（6）HLA-G可改變細(xì)胞因子的分泌模式，誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th2方向漂移，使Th2型細(xì)胞因子（IL-10和IL-12）分泌增多，降低機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。

本研究結(jié)果顯示，正常膀胱黏膜組織中HLA-G無表達(dá)，而膀胱移行細(xì)胞癌組織中HLA-G高表達(dá)（69.4%），提示膀胱移行細(xì)胞癌中HLA-G顯著表達(dá)是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)，HLA-G可能協(xié)助膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，并成功種植生長。HLA-G可抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，而后者在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，推測HLA-G與腫瘤的演進(jìn)可能具有一定的相關(guān)性。另外，HLA-G在不同性別、年齡的膀胱移行細(xì)胞癌患者中的表達(dá)水平無差異，在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤數(shù)目、腫瘤的臨床分期、病理分級無明顯相關(guān)性，提示HLA-G蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的病程進(jìn)展無關(guān)。這可能與以下因素有關(guān)：（1）腫瘤免疫逃逸的產(chǎn)生有多種機(jī)制，且存在復(fù)雜相互關(guān)系與協(xié)同作用以及腫瘤微環(huán)境的影響，單一因素的改變對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不能起到?jīng)Q定作用；（2）HLA-G有多種異構(gòu)體，目前檢測的多為HLA-G1，sHLA-G也能發(fā)揮同樣的作用，在不同類型的癌組織中，HLA-G表達(dá)類型可能不同；（3）所用的HLA-G單克隆抗體不同，其敏感性不同。因此，受到檢測方法的限制，不能完全反映其表達(dá)水平。

[1] 那彥群,郭震華.實(shí)用泌尿外科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:280.

[2] Gomes A Q,Correia D V,Silva-Santos B.Non-classical major histocompatibility complex proteins as determinants of tumour immunosurveillance[J].EMBO Reports,2007,8(11):1024-1030.

[3]Pavelee Q,Zeuthen J,Kiessling R.Eseapefromhost-antitumorimmunity[J].Crit Rev Oneol,1997,8:111-141.

[4] Seliger B,Schlaf G.Structure,expression and function of HLA-G in renal cell carcinoma[J].Semin Cancer Biol,2007,17:444-450.

[5]Rebmann V,Wagner S,Grosse-Wilde H.HLA-G expression in malignant melanoma[J].Semin Cancer Biol,2007,17(6):422-429.

[6] Palmisano G L,Pistillo M P,Fardin P,et al.Analysis of HLA-G expression in breast cancer tissues[J].Hum Immunol,2002,63 (11):969-976.

[7] Yan W H,Lin A,Chen B G,et al.Unfavourable clinical implications for HLA-G expression in acute myeloid leukaemia[J].J Cell Mol Med,2008,12(3):889-898.

[8] Li B L,Lin A,Zhang X J,et al.Characterization of HLA-G expression in renal cell carcinoma[J].Tissue Antigens,2009,74(3): 213-221.

[9] Lin A,Zhang X,Zhou W J,et al.Human leukocyte antigen-G expression is associated with a poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer,2011,129 (6):1382-1390.

[10] Rouas-Freiss N,Moreau P,Menier C,et al.Expression of tolerogenic HLA-G molecules in cancer prevents antitumor responses[J].Semin Cancer Biol,2007,17(6):413-421．

[11]Chang C C,Campoli M,Ferrone S.HLA class I antigen expression in malignant cells:why does it not always correlate with CTL-mediated lysis[J].Curr Opin Immunol,2004,16:644-650.

[12]Kim R,Emi M,Tanabe K.Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape[J].Immunology,2007,121:1-14.

[13]Puppo F,Contini P,Ghio M,et al.Soluble HLA class I molecules/CD8 ligation trigger apoptosisofCD8+cellsbyFas/ Fas-ligand interaction[J].Sci World J,2002,2:4212-4213.

[14] Favier B,LeMaoult J,Rouas-Freiss N,et al.Research on HLA-G:an update[J].Tissue Antigens,2007,69:207-211.

（本文編輯：歐陽卿）

《浙江醫(yī)學(xué)》對圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應(yīng)冠有圖題。說明性的文字應(yīng)置于圖下方注釋中，并在注釋中標(biāo)明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應(yīng)墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計算機(jī)制圖者應(yīng)提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對比度；圖中需標(biāo)注的符號（包括箭頭）請用另紙標(biāo)上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明圖號、方向及作者姓名。若刊用人像，應(yīng)征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分。大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有尺度標(biāo)記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。圖表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計和統(tǒng)計學(xué)處理內(nèi)容（如 值、值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)數(shù)據(jù)要求同一指標(biāo)有效位數(shù)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的1/3確定有效位數(shù)。

本刊編輯部

ObjectiveTo investigate the expression of HLA-G in bladder transitional carcinoma(BTCC)and its correlation with clinicopathological characteristicsMethodsEnvision immunohistochemistry analysis was performed to evaluate the expression of HLA-G in 62 cases of bladder transitional carcinoma and 20 cases of tumor-adjacent normal bladder mucosa tissue. The correlation of HLA-G protein expression with clinicopathological characteristics was analyzed.ResultsThe positive rate of HLA-G expression in BTCC was 69.4%(43/62),while no positive HLA-G expression(0/20)was found in normal bladder mucosa. HLA-G expression was not correlated with sex,age,tumor number,grade,stage(P＞0.05)in BTCC.ConclusionHLA-G expression is commonly up-regulated in BTCC,which is not associated with clinicopathological characteristics of BTCC.

Bladder cancerImmunohistochemistry HLA-G

2012-04-25）

318500 臺州醫(yī)院路橋院區(qū)泌尿外科（黃理福、朱汝健），婦產(chǎn)科（王小紅）；臺州醫(yī)院泌尿外科（張顯軍、柯莽、俞洪元、王天濟(jì)），組織庫（林愛芬）

Expression of HLA-G and its correlation with clinicopathological characteristics of bladder transitional carcinoma