黃紅光 沈建 劉文超

溴酚藍(lán)對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的染色作用

黃紅光 沈建 劉文超

目的 研究溴酚藍(lán)對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤模型的染色作用，為手術(shù)精確切除人腦膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法建立Fischer 344大鼠膠質(zhì)瘤模型，MRI檢查證實(shí)。靜脈注射不同劑量（30～360mg/kg）溴酚藍(lán)，15min后處死取腦，檢查溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤的染色情況；并注射相同劑量（180mg/kg）的溴酚藍(lán)，在不同時(shí)間處死取腦，檢查溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤的染色情況。對(duì)無(wú)瘤實(shí)驗(yàn)大鼠注射不同劑量溴酚藍(lán)，觀察其毒性反應(yīng)。結(jié)果溴酚藍(lán)對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤有明顯的染色作用，其染色與周圍腦組織有清晰的界限，染色時(shí)間出現(xiàn)在注射后10min～6h。30d未觀察到溴酚藍(lán)的任何毒性反應(yīng)。結(jié)論溴酚藍(lán)在不同時(shí)間點(diǎn)能夠清晰染色大鼠膠質(zhì)瘤，有可能作為人腦膠質(zhì)瘤的術(shù)中染色劑來(lái)區(qū)別腫瘤組織和正常腦組織。

溴酚藍(lán) 膠質(zhì)瘤 染色

目前，腦膠質(zhì)瘤的治療依然是臨床神經(jīng)學(xué)科所面臨的一個(gè)難題。膠質(zhì)瘤具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、邊界不清的特點(diǎn)，手術(shù)過程中常難以切除全部腫瘤，而且常規(guī)術(shù)后放療、化療效果不理想。多數(shù)研究認(rèn)為，腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后主要與腫瘤的切除程度密切相關(guān)。因此，找到一種能夠在顯微手術(shù)中直接染色腦膠質(zhì)瘤的方法，從而為腦膠質(zhì)瘤的治療提供一條捷徑顯得尤為重要。本研究利用溴酚藍(lán)對(duì)腫瘤的染色作用，旨在探討其對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤模型的染色作用和效果。

1 材料和方法

1.1 材料 試驗(yàn)細(xì)胞：9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞，德國(guó)基爾大學(xué)惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用溴酚藍(lán)購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司，常溫保存。試驗(yàn)動(dòng)物：Fisher 344大鼠54只，體重200～220g，購(gòu)自浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及種植

1.2.1 9L細(xì)胞體外培養(yǎng) 將9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于含10%FBS、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)瓶中單層培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞，以pH值為7.4的PBS洗滌，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為107個(gè)細(xì)胞/ml。細(xì)胞懸液常規(guī)取樣，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞比率均＞95%。

1.2.2 大鼠腦內(nèi)9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植 取42只Fisher 344大鼠，腹腔注射氯胺酮（80mg/kg）和賽拉嗪（13mg/ kg）麻醉后，固定于腦立體定向儀上。頭部去毛，常規(guī)消毒后沿中線縱向切開頭皮約1cm，暴露前囟，用直徑1mm的牙科鉆小心鉆穿顱骨并切除部分顱骨（直徑約5mm）。取顱骨開窗的中心（前囟中點(diǎn)前1.5mm，矢狀縫向右旁開2.5mm），以10μl注射器抽取配好的細(xì)胞懸液5μl（5×104個(gè)細(xì)胞），緩慢垂直顱骨進(jìn)針3mm，回退0.5mm，緩慢注入細(xì)胞懸液。用聚氯乙烯膜封閉骨孔，縫合頭皮，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 MRI檢查 種植后10～12d行MRI增強(qiáng)檢查：腹腔下麻醉，行俯臥橫斷位、冠狀位T1WI、T2WI及增強(qiáng)掃描。發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)狀強(qiáng)化者為腫瘤成活標(biāo)志。

1.4 不同劑量、不同時(shí)點(diǎn)溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤染色情況的檢測(cè)

1.4.1 不同劑量溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤染色情況的檢測(cè) 細(xì)胞種植后14d，F(xiàn)isher 344大鼠腹腔注射氯胺酮（80mg/ kg）和賽拉嗪（13mg/kg）麻醉后，固定于腦立體定向儀上。各組（每組3只）實(shí)驗(yàn)鼠分別靜脈緩慢注射不同劑量的溴酚藍(lán)（30、60、120、180、240、360mg/kg）及0.9%氯化鈉溶液1ml。15min后處死大鼠并取腦，10%中性甲醛溶液固定后冠狀切成2mm厚的組織塊。含有腦瘤的組織塊常規(guī)石蠟包埋，間隔0.5mm連續(xù)切片，行HE染色，光鏡下檢查，判斷溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤的染色情況。

1.4.2 不同時(shí)點(diǎn)溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤染色情況的檢測(cè) 同樣條件下，各組（每組3只）實(shí)驗(yàn)鼠靜脈緩慢注射溴酚藍(lán)180mg/kg，在注射后不同時(shí)間點(diǎn)（10、30min及1、2、4、6、8h）處死大鼠并取腦，行大體病理檢查和HE染色后組織學(xué)檢查，判斷溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤的染色情況。

1.5 溴酚藍(lán)的安全性檢測(cè) 12只無(wú)瘤大鼠分為4組（每組3只），分別靜脈緩慢注射不同劑量的溴酚藍(lán)（60、180、360mg/kg）和0.9%氯化鈉溶液1ml，共同飼養(yǎng)，觀察其行為，監(jiān)測(cè)體重。30d后處死，取其心、肝、腎、腦等臟器行病理檢查。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦膠質(zhì)瘤模型MRI表現(xiàn) 在種植后10～12d所有大鼠均進(jìn)行MRI檢查，行T1WI、T2WI平掃及增強(qiáng)掃描，以出現(xiàn)強(qiáng)化灶為接種成功。結(jié)果顯示，所有大鼠均接種成功，腫瘤瘤體直徑約為3～4mm，在T1W呈現(xiàn)略高信號(hào)，T2W為高信號(hào)，增強(qiáng)掃描腫瘤更加明顯。其MRI影像見圖1。

圖1 大鼠腦膠質(zhì)瘤的MRI影像（a：T1相，b：T2相，c：T1強(qiáng)化）

2.2 溴酚藍(lán)染色效果 不同劑量的溴酚藍(lán)對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤均有染色作用（圖2）：30mg/kg劑量的溴酚藍(lán)對(duì)腫瘤的染色很淡，120mg/kg劑量的染色較明顯，360mg/kg劑量的染色非常清楚?？傮w上，溴酚藍(lán)對(duì)腫瘤染色效果與注射劑量呈正比關(guān)系。不同時(shí)間點(diǎn)溴酚藍(lán)對(duì)腦腫瘤的染色情況（圖3a～c）：在注射180mg/kg溴酚藍(lán)10min后就出現(xiàn)明顯的腫瘤染色，而后其強(qiáng)度隨時(shí)間推移下降，至注射后4h時(shí)腫瘤仍有較清楚的染色，6h后腫瘤染色基本消失。在包含腫瘤大鼠腦冠狀切面上，可見溴酚藍(lán)均勻的分布到整個(gè)腫瘤的中樞和外周區(qū)域，腦腫瘤和正常腦組織之間存在清晰可見的的界面。HE染色后組織學(xué)光鏡檢查（圖3d）與大體病理檢查的結(jié)果類似。

圖2 不同劑量的溴酚藍(lán)對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤的染色表現(xiàn)（a：對(duì)照，b：30mg/kg，c：120mg/kg，d：360mg/kg）

圖3 不同時(shí)點(diǎn)溴酚藍(lán)對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤的染色表現(xiàn)和組織學(xué)光鏡檢查結(jié)果（a：10min，b：30min，c：4h；d：組織學(xué)光鏡）

2.3 溴酚藍(lán)安全性檢測(cè)結(jié)果 9只注射不同劑量溴酚藍(lán)的無(wú)瘤大鼠與正常大鼠共同飼養(yǎng)30d，其行為與正常大鼠表現(xiàn)一致，體重增加也不明顯。僅發(fā)現(xiàn)注射360mg/kg溴酚藍(lán)的大鼠在注射后出現(xiàn)一過性皮膚變藍(lán)。30d后處死大鼠，其主要器官的病理學(xué)檢查也無(wú)異常。

3 討論

目前，臨床上普遍認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間與腫瘤的切除程度密切相關(guān)[1-4]。Lacroix等[1]對(duì)416例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存時(shí)間與腫瘤的切除程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤切除程度在98%以上的患者，其生存時(shí)間比腫瘤切除程度在98%以下的患者長(zhǎng)4.2個(gè)月。由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)過程中在腫瘤的邊緣，難以辨別腫瘤組織和正常腦組織，為了保護(hù)神經(jīng)功能，又不能無(wú)限制的切除腫瘤，常規(guī)的顯微外科手術(shù)很難達(dá)到如此高的腫瘤切除率。因此，若能在手術(shù)過程中區(qū)別腫瘤和正常腦組織，就能夠最大程度的切除腫瘤組織，提高惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。膠質(zhì)瘤的術(shù)中定位手術(shù)，如應(yīng)用神經(jīng)外科導(dǎo)航技術(shù)和術(shù)中MRI掃描技術(shù)實(shí)施惡性膠質(zhì)瘤的顯微切除手術(shù)，能夠在術(shù)中對(duì)腫瘤組織作出良好的定界，從而提高腦腫瘤的切除程度，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間[5]。但此類手術(shù)設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)開展較緩慢。

溴酚藍(lán)屬于水溶性的三苯甲烷，作為工業(yè)染料被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食物行業(yè)和實(shí)驗(yàn)研究中[6-7]。Senekowitsch等[6]發(fā)現(xiàn)，靜脈給藥后，溴酚藍(lán)能選擇性的積蓄在大鼠的肺腫瘤中，應(yīng)用放射性核素標(biāo)志的溴酚藍(lán)研究其藥物代謝情況，發(fā)現(xiàn)在正常大鼠中溴酚藍(lán)的肺、血濃度之比為1∶1；而在肺癌模型大鼠中溴酚藍(lán)的肺、血濃度之比為2∶1；24h后絕大部分溴酚藍(lán)通過腸道排出體外。筆者應(yīng)用溴酚藍(lán)染色大鼠9L膠質(zhì)瘤模型，取得了良好的效果。首先，為確保膠質(zhì)瘤模型的建立，筆者應(yīng)用MRI檢查了9L細(xì)胞接種的實(shí)驗(yàn)大鼠，證實(shí)所有大鼠在接種后的10～12d均有腫瘤形成，MRI顯示大鼠腦腫瘤具備人腦質(zhì)瘤的影像特征，不規(guī)則形成且明顯強(qiáng)化的實(shí)質(zhì)性腫瘤。這表明該模型具有良好的可預(yù)測(cè)性和可重復(fù)性，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察提供了良好的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在靜脈給予不同劑量的溴酚藍(lán)后，腦腫瘤出現(xiàn)明顯的染色，其染色強(qiáng)度與用藥劑量成正比；腦膠質(zhì)瘤的染色出現(xiàn)在給藥后10min，并持續(xù)到給藥后6h左右，而正常腦組織不出現(xiàn)染色，兩者之間有清楚的界線。組織學(xué)檢查結(jié)果也證實(shí)，溴酚藍(lán)的染色主要聚結(jié)在腦膠質(zhì)瘤的范圍內(nèi)。一般而言，腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)，在開顱后切除腫瘤的時(shí)間大多為2～4h，這表明溴酚藍(lán)有可能作為神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除時(shí)合適的腫瘤顯色劑，在術(shù)中可幫助區(qū)別腫瘤和正常腦組織。對(duì)于手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)的患者，術(shù)中可以再次靜注溴酚藍(lán)，以達(dá)到較好的染色效果。目前，溴酚藍(lán)腫瘤染色的機(jī)制尚不明確，筆者分析可能與腦腫瘤選擇性的積蓄溴酚藍(lán)以及與其血腦屏障的破壞有關(guān)。

此外，進(jìn)一步的安全性研究證實(shí)，不同劑量的溴酚藍(lán)連續(xù)給藥30d，對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、行為和重要器官的功能無(wú)影響。Balaiya等[7]通過研究不同的染色劑對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)溴酚藍(lán)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性反應(yīng)很小。Lin等[8]用多種方法驗(yàn)證溴酚藍(lán)的基因毒性，發(fā)現(xiàn)溴酚藍(lán)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因無(wú)毒性反應(yīng)。這些結(jié)果均提示溴酚藍(lán)有可能作為腦膠質(zhì)瘤的術(shù)中染色劑來(lái)區(qū)別腫瘤組織和正常腦組織，以確保達(dá)到進(jìn)一步切除腫瘤的目的。

[1] Lacroix M,Abi-Said D,Fourney D R,et al.A multivariate analysis of 416 patients with glioblastoma multiforme:prognosis,extent of resection,and survival[J].J Neurosurg,2001,95(2):190-198.

[2]Habberstad A H,Lind-Landstrm T,Sundstrm S,et al.Primary human glioblastomas - prognostic value ofclinicaland histopathological parameters[J].Clin Neuropathol,2012,31(5): 361-368.

[3] Brown P D,Maurer M J,Rummans T A,et al.A prospective study of quality of life in adults with newly diagnosed high-grade gliomas:the impact of the extent of resection on quality of life and survival[J].Neurosurgery,2005,57(3):495-504.

[4] Kuhnt D,Becker A,Ganslandt O,et al.Correlation of the extent of tumor volume resection and patient survival in surgery of glioblastoma multiforme with high-field intraoperative MRI guidance[J].Neuro Oncol,2011,13(12):1339-1348.

[5] Gasser T,Szelenyi A,Senft C,et al.Intraoperative MRI and functional mapping[J].Acta Neurochir Suppl,2011,109:61-65.

[6] Senekowitsch R,Mollenstadt S.Prolonged retention of 77Br labelled bromphenol blue in tumor tissue[J].Int J Nucl Med Biol, 1984,11(1):60-63.

[7] Balaiya S,Brar V S,Murthy R K,et al.Comparative in vitro safety analysis of dyes for chromovitrectomy:indocyanine green,brilliant blue green,bromophenol blue,and infracyanine green[J]. Retina,2011,31(6):1128-1136.

[8] Lin G H,Brusick D J.Mutagenicity studies on two triphenylmethane dyes,bromophenol blue and tetrabromophenol blue[J]. J Appl Toxicol,1992,12(4):267-274.

Bromophenol blue staining of tumors in a rat glioma model

ObjectiveTo investigate the uptake of bromophenol blue(BPB)in experimental rat glioma.MethodsGlioma model was established in Fischer 344 rats and confirmed by MRI.Different doses(30～360mg/kg)of BPB were administrated by intravenous injection in glioma-bearing rats.Fifteen minutes after BPB injection,the animals were sacrificed and their brains were removed for monitoring tumor staining.In a subsequent study,180 mg/kg BPB was injected and the animals were sacrificed at several time points to monitor tumor staining over time.Also,we conducted a toxicity study with intravenous injections of different dose BPB in nontumor-bearing Fischer 344 rats.ResultsThe BPB staining was clearly visible and mainly localized in the tumor. In an additional experiment,we found that tumor staining persisted from 10min to 6h after BPB injection.No adverse effects were observed in animals during the 30d-observation period.ConclusionBPB can visualize experimental rat glioma at different time points and it may be potentially useful in helping neurosurgeons to visualize human brain tumors.

Bromophenol blue Glioma Staining

2012-11-29）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（2009A080）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科