陳國(guó)中 徐珊 張永生 朱飛葉

化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠組織病理學(xué)及羥脯氨酸含量的影響

陳國(guó)中 徐珊 張永生 朱飛葉

目的 觀察化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化的療效，并進(jìn)一步探討其抗纖維化的作用機(jī)制。方法取清潔級(jí)健康成年Wistar大鼠60只，隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組，其余50只采用經(jīng)典模型復(fù)制后隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（造模過程中死亡11只），模型對(duì)照組（10只）、復(fù)方鱉甲軟肝片組（7只）、和化痰行瘀湯低（7只）、中（7只）、高（6只）劑量組，分別以相應(yīng)藥物連續(xù)干預(yù)6周。采用樣本堿水解法檢測(cè)各組大鼠部分肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量；并采用常規(guī)HE染色和苦味酸-天狼紅染色觀察肝纖維化程度。結(jié)果復(fù)方鱉甲軟肝片組、化痰行瘀湯各劑量組能明顯改善肝纖維化程度；化痰行瘀湯中劑量組的病理改變明顯，明顯降低肝組織Hyp含量（P＜0．05）。結(jié)論化痰行瘀湯能降低肝組織Hyp含量，明顯減輕病理改變，有效改善肝纖維化。

化痰行瘀湯 肝纖維化 大鼠 組織病理學(xué) Hyp

【 Abstract】 ObjectiveTo assess the therapeutic effects of Huatan Xingyu (HTXY)decoction on experimental hepatic fibrosis in rats．MethodsSixty adult Wistar rats were included into 6 groups(n=10 in each):normal control group,model control group,Fufang Biejia Ruangan group,low-dose HTXY group,middle-dose HTXY group and high-dose HTXY group．The corresponding drugs were given for 6 weeks．After treatment,the hydroxyproline(Hyp)levels in hepatic tissues were detected by alkali hydrolysis method and the pathological changes of hepatic fibrosis were observed by HE staining and picric acid-sirius red staining．ResultsCompared to normal control and model control groups,the degree of hepatic fibrosis were significantly attenuated in Fufang biejia ruangan group and HTXY decoction groups(P＜0．05),and more markedly in middle-dose group．The Hyp levels in hepatic tissues were also significantly decreased in middle-dose HTXY group(P＜0．05)．ConclusionHTXY decoction can improve hepatic fibrosis and reduce hepatic tissue Hyp levels in rats with experimental hepatic fibrosis．

肝纖維化（hepatic-fibrosis，HF）是慢性肝病向肝硬化轉(zhuǎn)變的必經(jīng)途徑，研究HF對(duì)預(yù)防肝硬化有深遠(yuǎn)意義。本課題組挖掘國(guó)家名老中醫(yī)徐珊教授臨床數(shù)十年治療HF的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合有關(guān)HF文獻(xiàn)，提出化痰行瘀法抗HF，并采用其經(jīng)驗(yàn)方“化痰行瘀湯”進(jìn)行抗HF療效實(shí)驗(yàn)研究。本文主要闡述化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠組織病理學(xué)及羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）的影響。

1 材料和方法

1.1 主要藥物及試劑的制備 取國(guó)家名老中醫(yī)徐珊臨床經(jīng)驗(yàn)方化痰行瘀湯方（桃仁10g、丹參10g、赤芍10g、郁金10g、浙貝15g、澤瀉30g）適量帖數(shù)，加水提取2次，第一次加3倍量水，浸泡0.5h，提取1.5h，第二次加1.5倍量水，提取1h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至1.785g/ml的煎劑，臨用前配成0.4464g/ml，0.8925g/ml，1.785g/ml的灌胃液，備用。復(fù)方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20100411）臨用前研細(xì)用蒸餾水調(diào)成0.1mg/l0ml混懸液。40%CCl4橄欖油溶液：取40ml CCl4溶液，加入60ml橄欖油，混勻。5× TBE電泳緩沖液：稱取54g Tris，27.5g硼酸，加入20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）補(bǔ)充雙蒸水至1 000ml，此緩沖液稀釋10倍后即為0.5×TBE。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 取清潔級(jí)健康成年Wistar大鼠60只，雄性，體重（200±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組，其余50只采用經(jīng)典模型復(fù)制法[1]按3ml/kg體重每周2次（首次加倍）皮下注射以橄欖油配制的40%CCl4，連續(xù)6周。正常對(duì)照組每周2次以等容量的橄欖油皮下注射。造模期間對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的進(jìn)食、飲水不予限制。

1.2.2 模型評(píng)價(jià) 第6周末，從造模動(dòng)物中隨機(jī)處死2只大鼠作HF病理學(xué)檢查，鏡下見中等度HF形成（纖維隔形成并互相連接，深入小葉內(nèi)，小葉結(jié)構(gòu)保留或紊亂，但無肝硬化），即確定HF模型復(fù)制成功[2]。造模結(jié)束后大鼠死亡11只，剩余37只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：模型對(duì)照組10只、復(fù)方鱉甲軟肝片組7只、化痰行瘀湯低劑量組7只、化痰行瘀湯中劑量組7只、化痰行瘀湯高劑量組6只。

1.3 藥物干預(yù) 于分組當(dāng)天開始灌胃給藥，復(fù)方鱉甲軟肝片組以1g/（kg·d）灌胃，化痰行瘀湯低、中、高劑量組分別以50、100、200mg/kg每天灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組用0.9%氯化鈉溶液灌胃，2ml/d，連續(xù)給藥6周。給藥期間正常進(jìn)食及飲水。

1.4 標(biāo)本的采集及制備 治療6周結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24h，用10%水合氯醛溶液（按4ml/kg體重）腹腔注射麻醉后剖腹，腹主動(dòng)脈取血，5ml/只，靜置2h以上，3 500r/min，離心15min，吸取上清液，移至EP管中，封口，置-80℃冰箱中保存待測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 常規(guī)病理學(xué)檢查 （1）常規(guī)蘇木素-伊紅染色（HE染色）；（2）天狼紅染色。膠原增生的判斷按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HF組織學(xué)Ⅳ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]（以下簡(jiǎn)稱“Ⅳ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)”）光鏡下觀察肝組織膠原纖維、網(wǎng)狀纖維分布。

1.5.2 肝臟組織中羥脯氨酸（Hyp）含量檢測(cè) 采用樣本堿水解法測(cè)定Hyp含量，操作步驟如下：（1）準(zhǔn)確稱取肝組織放入試管中，準(zhǔn)確加水解液1.0ml，混勻。加蓋后沸水浴水解20min（水解10min混勻一次，目的是使水解更充分）；（2）將各試管流水冷卻后各管加指示劑1滴，混勻；（3）各管準(zhǔn)確加入調(diào)pH甲液1.0ml至溶液變紅，混勻；（4）各管逐滴小心加入調(diào)pH乙液，混勻，至顏色變成黃綠色，pH值在6.0左右；（5）加蒸餾水至 10ml，混勻；（6）取稀釋后的檢測(cè)液3ml加適量活性炭，混勻，3 500r/min，離心10min，取上清液1.0ml直接按表1方法檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。

表1 Hyp含量測(cè)定操作表

2 結(jié)果

2.1 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠組織病理學(xué)的影響

2.1.1 肝組織HE染色光鏡觀察 HE染色光鏡下觀察（圖1）：正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝竇與匯管區(qū)成纖維細(xì)胞少（圖1A）；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞空泡變性，部分匯管區(qū)和小葉內(nèi)有碎屑?jí)乃溃倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)細(xì)胞大量彌漫增生，纖維組織增生明顯，部分出現(xiàn)纖維間隔互相包繞整個(gè)肝小葉，假小葉形成（圖1B）；復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝細(xì)胞壞死和纖維組織增生明顯減輕（圖1C）；化痰行瘀湯低劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，肝細(xì)胞變性以脂肪變?yōu)橹?，少量炎性?xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞壞死減輕，纖維組織增生減輕（圖1D）；化痰行瘀湯中劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，肝細(xì)胞壞死和纖維組織增生明顯減輕（圖1E）；化痰行瘀湯高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，肝細(xì)胞空泡變性減少，炎性反應(yīng)及壞死減輕，纖維組織增生不明顯，接近正常肝組織（圖1F）。

2.1.2 肝組織苦味酸-天狼紅染色光鏡觀察 苦味酸-天狼紅染色光鏡下觀察（圖2）：正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，僅在中央靜脈及肝竇內(nèi)有少量膠原纖維分布（圖2A）；模型組大鼠肝組織匯管區(qū)和小葉間可見大量粗大增生的膠原纖維，相鄰匯管區(qū)之間纖維間隔連接并包繞形成以大方形和小圓形為主的假小葉（圖2B）；復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織匯管區(qū)纖維組織延伸明顯，部分纖維互相連接包繞整個(gè)肝小葉（圖2C）；化痰行瘀湯低劑量組大鼠肝組織匯管區(qū)纖維組織延伸明顯，部分纖維間隔形成，包繞整個(gè)肝小葉（圖2D）；化痰行瘀湯中劑量組大鼠肝組織匯管區(qū)纖維延伸明顯，但未包繞整個(gè)肝小葉（圖2E）；化痰行瘀湯高劑量組大鼠肝組織可見少量膠原纖維自匯管區(qū)或中央靜脈向外延伸（圖2F）。2.1.3 各組肝組織膠原增生程度 見表2。

由表2可見，正常對(duì)照組未出現(xiàn)HF表現(xiàn)。各治療組與模型組比較HF程度差異明顯?；敌叙鰷鲃┝拷M與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較HF程度相近。化痰行瘀湯各劑量組間HF程度相近。

圖1 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠肝臟組織病理變化的影響（A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：復(fù)方鱉甲軟肝片組；D：化痰行瘀湯低劑量組；E：化痰行瘀湯中劑量組；F：化痰行瘀湯高劑量組；HE染色，×200）

表2 各組大鼠肝臟組織HF分級(jí)比較（例）

圖2 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠肝臟組織纖維化程度的影響（A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：復(fù)方鱉甲軟肝片組；D：化痰行瘀湯低劑量組；E：化痰行瘀湯中劑量組；F：化痰行瘀湯高劑量組；天狼紅染色×200倍）

2.2 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠肝臟組織Hyp的影響 見表3。

由表3和圖1可見，模型組Hyp較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。各治療組Hyp都有不同程度的下降，化痰行瘀湯中劑量組下降最為明顯（P＜0.05）?；敌叙鰷鲃┝拷M與復(fù)方鱉甲軟肝片組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。化痰行瘀湯各劑量組間比較，Hyp差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠Hyp含量影響比較

3 討論

HF是指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellu-larmatrix， ECM）成分過度增生與異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或功能異常的病理變化，是各種慢性肝病共有的病理特征，是發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段。而以肝星狀細(xì)胞（hepatic satellitecel，HSC）為中心環(huán)節(jié)，由枯否細(xì)胞、自然殺傷（naturalkiller，NK）細(xì)胞以及其他各種細(xì)胞和細(xì)胞間相互作用的信號(hào)因子共同構(gòu)成，以綜合調(diào)控的方式影響HF的進(jìn)程[4-5]。HSC在HF的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[6-8]。慢性肝損傷通過某些途徑激活靜止態(tài)HSC，活化的HSC產(chǎn)生大量ECM，ECM在Diss間隙內(nèi)過度沉積，最終導(dǎo)致HF產(chǎn)生[9-10]。HSC與肝NK細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝細(xì)胞以及聚集于肝臟的其他炎癥細(xì)胞以相應(yīng)的信號(hào)分子為介質(zhì)，發(fā)生復(fù)雜交叉感應(yīng)，打破細(xì)胞外基質(zhì)的生成與降解平衡，觸發(fā)HF。大量的研究結(jié)果證實(shí)：HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞（MFBs）和成纖維細(xì)胞（FC）及大量合成、分泌ECM是HF發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)和共同通路[9]。調(diào)節(jié)HSC活化和ECM代謝是抗HF的關(guān)鍵。

化痰行瘀湯是國(guó)家名老中醫(yī)徐珊教授多年臨床治療HF行之有效的經(jīng)驗(yàn)方，課題組研究認(rèn)為HF中醫(yī)病機(jī)是酒食、情志、濕熱疫毒、蠱毒等多病因侵犯肝臟，肝的疏泄失職，藏血失調(diào)，氣滯血瘀，肝脾不和，脾失健運(yùn)，濕停痰聚，瘀責(zé)之肝，痰責(zé)之脾，瘀痰互結(jié)，故用化痰行瘀法來改善肝組織病理學(xué)，達(dá)到抗HF效果。

3.1 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠組織病理學(xué)的影響 HF是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，以肝內(nèi)ECM過度沉積為特征。膠原纖維為ECM的主要成分之一，觀察膠原纖維沉積程度是研究HF的主要方法之一。本實(shí)驗(yàn)中通過HE、苦味酸-天狼紅染色，觀察了化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠肝組織病理學(xué)的影響。光學(xué)顯微鏡下觀察顯示：模型組肝臟組織脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維沉積、肝小葉破壞、假小葉形成，均提示本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功?；敌叙鰷鲃┝拷M明顯改善HF程度，尤其是高劑量組鏡下顯示肝小葉結(jié)構(gòu)保持相對(duì)完整，僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積，提示其具有抗HF作用。HF的病理表現(xiàn)與中醫(yī)癥瘕積聚關(guān)系密切，可以作為癥瘕積聚的微觀表現(xiàn)，化痰行瘀湯明顯改善了HF程度，這可能與祛濕化痰、活血祛瘀藥物軟堅(jiān)散結(jié)的作用有關(guān)，減少膠原纖維的沉積，從而起到了抗HF的作用。

3.2 化痰行瘀湯對(duì)HF大鼠肝臟組織Hyp的影響 Hyp在膠原組織中含量豐富[9]，系膠原肽鏈合成后，在脯氨酸羥化酶作用下，將肽鏈上的脯氨酸羥化形成，同時(shí)已形成的膠原又在膠原酶作用下分解，釋放Hyp，而膠原降解后，Hyp不再重復(fù)利用，從而使血中Hyp含量增加。肝組織Hyp代表了肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的膠原纖維的增生，較血清Hyp更可以直接反映HF的程度和演變過程。本實(shí)驗(yàn)中不同劑量化痰行瘀湯治療后，肝臟組織Hyp含量都有不同程度下降，表明本方能改善肝臟HF程度。

[1]孟愛紅．銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟COX-2表達(dá)的影響[D]．浙江中醫(yī)藥大學(xué),2010．

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)肝纖維化學(xué)組．肝纖維化診斷及療效評(píng)估共識(shí)[J]．中華肝臟病雜志,2002,10:327-328．

[3]Gao B,Jeong W,Tian Z G．Liver:an organ with Predominant innate immunity[J]．HePatology,2008,47(2):729-736．

[4] Racanelli V,Rehermann B．The liver as an immunological organ [J]．HePatology,2006,43(Suppl1):S54-S62．

[5] Kisseleva T,Brenner D A．Hepatic stellate cells and the reversal of fibrosis[J]．J Gastroenterol Hepatol,2006,21(S3):S84-S87．

[6]Henderson N C,Forbes S J．Hepatic fibrogenesis:from within and outwith[J]．Toxicology,2008,254(3):130-135．

[7] Atzori L,Poli G,Perra A．Hepatic stellate cell:a star cell in the liver [J]．Int J Biochem Cell Biol,2009,41(8-9):1639-1642．

[8] Bataller R,Brenner D A．Liver fibrosis[J]．J Clin Invest,2005,115: 209-218．

[9]Friedman S L,Rockey D C,Bissell D M．HePatic fibrosis 2006:Re-Port of the Third AASLD single to Pic conference[J]．HePatology, 2007,45(1):242-249．

[10]王寶恩,王惠吉,朱家璇,等．中藥復(fù)方丹參不同劑型治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察[J]．肝臟病雜志,1993,1(2):69-72．

[11]徐珊,周敏,包劍鋒,等．肝纖維化不同證型與肝功能和肝組織羥脯氨酸關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,26(9):1855-1857．

（本文編輯：田云鵬）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)計(jì)量單位的要求

本刊執(zhí)行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關(guān)量、單位和符號(hào)的規(guī)定及其書寫規(guī)則，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)雜志社編寫的《法定計(jì)量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》。注意單位名稱與單位符號(hào)不可混用。組合單位符號(hào)中表示相除的斜線多于1條時(shí)應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，組合單位中斜線和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應(yīng)先列出法定計(jì)量單位數(shù)值，括號(hào)內(nèi)寫舊制單位數(shù)值；如果同一計(jì)量單位反復(fù)出現(xiàn)，可在首次出現(xiàn)時(shí)注出法定與舊制單位換算系數(shù)，然后只列法定計(jì)量單位數(shù)值。量的符號(hào)一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號(hào)“”。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Efficacy of Huatan Xingyu Decoction in treatment of hepatic fibrosis in rats

Hua tan xing yu decoction Hepatic fibrosis Rats Histopathology Hydroxyproline

2012-11-21）

310012 杭州，浙江省立同德醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科（陳國(guó)中）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（徐珊、張永生、朱飛葉）