董婕 陳亞寧 王家建 沈宗姬

子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜激活素A、抑制素A的表達及意義

董婕 陳亞寧 王家建 沈宗姬

目的 探討激活素A（ACTA）、抑制素A（INHA）在子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）內(nèi)膜的表達及其臨床意義。方法收集30例EMS患者（EMS組）在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織，其中增生期16例，分泌期14例。同期正常子宮內(nèi)膜患者30例為對照組。采用免疫組織化學鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶法檢測兩組內(nèi)膜ACTA、INHA的表達；電化學發(fā)光法檢測兩組血清性激素E2、P水平。結(jié)果（1）EMS組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達水平均明顯高于對照組（均P＜0．05）。（2）EMS組在位內(nèi)膜增生期、分泌期ACTA、INHA表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0．05）。（3）EMS組在位內(nèi)膜增生期、分泌期ACTA、INHA表達水平與E2、P水平均無相關(guān)性（均P＞0．05）。對照組增生期ACTA、INHA表達水平均與E2水平呈正相關(guān)（均P＜0．05）；對照組分泌期ACTA、INHA表達水平與E2、P水平均呈正相關(guān)（均P＜0．05）。結(jié)論ACTA、INHA在EMS表達增強，提示ACTA、INHA可能參與EMS的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥 激活素A 抑制素A 在位內(nèi)膜 異位內(nèi)膜

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of activin A(ACTA)and inhibin A(INHA)in endometriosis and its clinical significance．MethodsEutopic and ectopic endometrial tissues were collected from women with endometriosis(ectopic group, n=30),among which,sixteen samples were in proliferative phase and the other were in secretory phase．Normal endometrial tissues(control group,n=30)were collected from women without endometriosis．Immunohistochemistry(IHC)SP method was conducted to detect the expression of ACTAand INHA．Chemiluminescence assay was performed to measure the expression levels of estrogen (E2)and progestogen (P)in serum of these participants．ResultsThe expression of ACTAand INHAwas significantly higher in the ectopic and eutopic endomtria than that in the normal endometrium(both P＜0．05)．There was no significant difference in ACTAand INHAexpression between proliferative and secretory phase in eutopic endometrium(P＞0．05)．In the proliferative or secretory phase of eutopic group,neither ACTAnor INHAexpression was correlated with the level of E2and P(P＞0．05)．Positive correlation was shown between expression of ACTA,INHAand E2(P＜0．05)in the proliferative phase of control group;in secretory phase of control group,expressions of ACTAand INHAwere positively correlated with E2(P＜0．05)and P(P＜0．05)．Conclusion The present data suggest that the increased expressions of ACTAand INHAin the eutopic and ectopic endometria of endometriosis patients may participate in the pathogenesis and progression of endometriosis．

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）在育齡婦女有10%～15%的發(fā)病率[1]，近年來有明顯上升趨勢，主要引起不孕、痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、盆腔包塊、月經(jīng)異常等，其發(fā)病機制復雜、病變廣泛、形態(tài)多樣，極具侵襲和復發(fā)性，有諸多棘手問題凾待解決。近年來，EMs基礎(chǔ)研究取得新進展，提出了黏附、侵襲和血管形成的3A發(fā)病模式（attachment-aggrassion-angiogenesis），而這個模式需要多種細胞因子和生長因子的協(xié)同作用。激活素、抑制素是二聚體相關(guān)蛋白，不同的亞單位構(gòu)成激活素A（ACTA）和抑制素A（INHA），是多功能的多肽類細胞因子，具有廣泛的生物學功能。本研究檢測了EMs患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中ACTA、INHA的表達，以探討其在EMs發(fā)病中可能的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2010-09—2011-11在湖州市婦幼保健院婦科收治經(jīng)病理確診的EMs患者30例，設(shè)為EMs組，年齡22～40（29.20±4.11）歲。取其在位內(nèi)膜（增生期16例，分泌期14例）及異位內(nèi)膜，根據(jù)1985年美國生育學會的EMs分期標準（r-AFS）進行分期，均為III-IV期。取同期因單純輸卵管因素不孕行腹腔鏡檢查和卵巢畸胎瘤或輸卵管系膜囊腫行腹腔鏡手術(shù)的患者30例正常內(nèi)膜為對照組（增生期16例，分泌期14例），年齡22～34（27.83±3.09）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組婦女術(shù)前至少3個月未使用性激素，排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜病變及其他內(nèi)分泌、免疫、代謝性疾病、心、肝、腎疾病；兩組婦女月經(jīng)周期規(guī)則、經(jīng)量中等。增生期于月經(jīng)周期第8～11天進行手術(shù)和采集標本，分泌期于月經(jīng)周期第17～20天進行手術(shù)和采集標本。所有標本按臨床倫理學要求在獲取前均征得患者同意。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及處理 于手術(shù)日晨抽取兩組婦女空腹肘靜脈血5ml，立即2 000r/min離心15min，取上清液置-20℃冰箱待測E2、P。EMs組腹腔鏡手術(shù)時取卵巢EMs囊壁組織1cm×1cm×1cm大小，同時刮取子宮內(nèi)膜1cm×1cm×0.5cm大小，對照組腹腔鏡手術(shù)時刮取子宮內(nèi)膜1cm×1cm×0.5cm大小，均立即用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，作HE染色確認月經(jīng)周期分期，同時作免疫組織化學（IHC）鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶（SP）法染色，按說明書操作。

1.2.2 IHC檢測ACTA、INHA的表達 IHC試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。IHC操作步驟嚴格按說明書進行。參考Ota等[2]IHC評分標準，對切片進行盲式閱片，每張片子隨機選擇5個互不重疊的高倍視野，觀察所選擇的高倍鏡視野中的所有細胞，記錄染色細胞百分數(shù)和染色強度并計分。陰性：＜5%的細胞呈陽性或者細胞顯色與背景一致，計0分；弱陽性：5%～10%的細胞呈陽性，計1分；陽性：11%～50%的細胞呈陽性，計2分；強陽性：＞50%的細胞呈陽性，計3分。細胞著色強度則以多數(shù)陽性細胞的染色計分：強著色：著色和已知陽性片同樣強，計3分；淺著色：淺著色、但與陰性對照片有明顯區(qū)別者計1分；染色強度在淺著色和強著色之間者為中等著色，計2分；無著色：著色和陰性對照片相同計0分。將百分數(shù)計分和細胞染色計分相加為IHC積分。

1.2.3 性激素測定 E2、P診斷試劑盒（電化學發(fā)光法）購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。羅氏E170免疫測定分析儀采用電化學發(fā)光法測定E2、P。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示，兩兩比較采用t檢驗，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中表達定位 ACTA、INHA表達陽性細胞的著色部位主要是在子宮內(nèi)膜腺體上皮細胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈淡黃色、深棕色或褐色，間質(zhì)細胞的胞質(zhì)也有少量表達，詳見圖1。

2.2 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中的表達比較 見表1。

表1 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中的表達比較（IHC積分）

由表1可見，EMs組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達水平均強于對照組（均P＜0.05）；而EMs組在位內(nèi)膜ACTA、INHA表達水平與異位內(nèi)膜比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 ACTA、INHA在對照組正常內(nèi)膜、EMs組在位內(nèi)膜增生期、分泌期表達比較 見表2。

表2 ACTA、INHA在對照組正常內(nèi)膜、EMs組在位內(nèi)膜增生期、分泌期表達比較

由表2可見，對照組正常內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA的表達水平均強于增生期（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。而EMs組在位內(nèi)膜增生期與分泌期ACTA、INHA表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。EMs組因異位內(nèi)膜與在位子宮內(nèi)膜周期并不同步，多表現(xiàn)為增生期改變，故未將異位內(nèi)膜進行分期。

2.4兩組ACTA、INHA表達水平與E2、P的相關(guān)性分析 EMs組增生期ACTA、INHA表達水平與E2、P水平均無相關(guān)性（r=0.133、0.235、-0.184、0.026，均P＞0.05）；EMs組分泌期ACTA、INHA表達水平與E2、P水平也均無相關(guān)性（r=0.279、0.016、0.148、0.048，均P＞0.05）。

對照組子宮內(nèi)膜增生期ACTA、INHA表達水平與E2水平均呈正相關(guān)（r=0.526、0.609，均P＜0.05）而與P水平均無相關(guān)性（r=-0.185、-0.295，均P＞0.05）；對照組子宮內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA表達水平與E2、P水平均呈正相關(guān)（r=0.537、0.740、0.536、0.684，均P＜0.05）。

圖1 ACTA、INHA在子宮內(nèi)膜的表達（A：ACTA在正常子宮內(nèi)膜增生期的表達；B：INHA在正常子宮內(nèi)膜增生期的表達；C：ACTA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達；D：INHA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達；E：ACTA在EMs在位內(nèi)膜增生期的表達；F：INHA在EMs在位內(nèi)膜增生期的表達；G：ACTA在EMs在位內(nèi)膜分泌期的表達；H：INHA在EMs在位內(nèi)膜分泌期的表達；I：ACTA在EMs異位內(nèi)膜的表達；J：INHA在EMs異位內(nèi)膜的表達；SP染色，×400）

3 討論

子宮內(nèi)膜細胞發(fā)生異位種植，需要經(jīng)過黏附、侵襲、血管形成的3A發(fā)病模式[3]。在這個過程中，細胞因子和生長因子的異常分泌參與組織重構(gòu)、血管再生和局部免疫反應(yīng)在其復雜的病理過程中發(fā)揮重要作用。ACT、INH則是產(chǎn)生于子宮內(nèi)膜并且可能是其中推定的一個因素。ACTA具有調(diào)節(jié)細胞的增殖性、黏附性、侵襲性以及影響血管形成等生物學作用。INHA具有生長因子樣作用，研究發(fā)現(xiàn)INH與ACT、TGF-β等都是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，具有自分泌、旁分泌生長因子活性，參與細胞增殖、分化、免疫功能、細胞凋亡和組織重構(gòu)[4]。ACTA、INHA及其受體在子宮內(nèi)膜的存在增加了ACT、INH也能夠參與EMs發(fā)生的可能性[5]。本研究中正常子宮內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜均表達ACTA、INHA，并且在EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達增強。本文的研究結(jié)果結(jié)合近年來關(guān)于EMs的異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜能產(chǎn)生和分泌ACTA、INHA的報道[6-7]，支持了ACTA、INHA在EMs發(fā)生中可能的作用。

在EMs我們認為ACTA可能對異常組織的重構(gòu)及與EMs有關(guān)的反應(yīng)相關(guān)，在其他組織ACTA的持續(xù)表達確實與纖維化相聯(lián)系。被Jones等[5]推測的子宮內(nèi)膜ACT的生理作用包括不同的功能如管理滋養(yǎng)細胞侵襲[8]和間質(zhì)細胞的蛻膜化[9]。特別相關(guān)的ACT在EMs公認的作用是觀察到ACT的出現(xiàn)是與包括子宮內(nèi)膜在內(nèi)[8-9]的各種組織的修復過程相聯(lián)系的。不僅ACTA調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達[9]和細胞外間質(zhì)部分的沉積[10]，而且ACTA似乎在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面扮演了一個重要的角色。進一步的研究中在損傷調(diào)節(jié)和炎癥相關(guān)的疼痛中ACT與之相關(guān)[11]，ACTA增加了感覺神經(jīng)元對疼痛必要的神經(jīng)肽的表達，提示ACTA可能也是一個重要的EMs相關(guān)疼痛的調(diào)解者。而INHA的生長因子樣作用有利于子宮內(nèi)膜干細胞異常脫落逆流入盆腔后進行增殖、分化，最終發(fā)展成EMs病灶。

本研究中，ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達強于增生期，但在EMs婦女在位內(nèi)膜ACTA、INHA的表達在分泌期沒有增長，與增生期的表達差異無顯著性，與Rocha等[12]的研究一致。健康婦女在分泌期ACTA、INHA表達增強這本身可能是內(nèi)膜成熟期內(nèi)的重要旁分泌信號，提示一個能接受的子宮內(nèi)膜信號[13-14]，這可能促進了在胚胎著床時滋養(yǎng)層的侵入，我們推測EMs患者ACTA、INHA表達在在位內(nèi)膜分泌期與增生期改變的缺乏與雌激素的持續(xù)作用等內(nèi)分泌因素有關(guān)，并可能與EMs的不孕相關(guān)。EMs的病理改變包括盆腔解剖的變形、內(nèi)分泌和排卵的異常，在位子宮內(nèi)膜的激素和免疫細胞媒介功能的改變[12]。證據(jù)顯示子宮內(nèi)膜功能的紊亂也與此相關(guān)聯(lián)。局部表達的多肽類/蛋白質(zhì)參與對其他細胞類型的受分泌信號調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的功能，他們的功能紊亂引發(fā)了EMs的病理情況。因此在EMs婦女分泌期與增生期改變的缺失可能更有助于EMs患者子宮內(nèi)膜功能的受損。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常子宮內(nèi)膜增生期ACTA、INHA的表達與E2呈正相關(guān)，在正常子宮內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA的表達與E2、P呈正相關(guān)。由此我們推測ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜的功能是通過與E2、P的作用來調(diào)節(jié)的，同時ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜也是通過影響E2、P的產(chǎn)生來發(fā)揮其功能的。ACTA、INHA與E2、P的相關(guān)性提示在正常子宮內(nèi)膜腺體一個復雜的自分泌/旁分泌機制，并由這些物質(zhì)調(diào)節(jié)和控制。這同樣提示了在正常子宮內(nèi)膜ACTA、INHA復雜的自分泌/旁分泌機制，雖然ACTA、INHA的調(diào)節(jié)產(chǎn)生、新陳代謝、管理的生物合成機制的細節(jié)尚未完全闡明。而在EMs在位內(nèi)膜ACTA、INHA的表達與E2、P無相關(guān)關(guān)系，提示EMs內(nèi)膜功能紊亂與內(nèi)分泌的關(guān)系，但具體的作用機制值得進一步研究。

EMs在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達的增強提示ACTA、INHA可能參與EMs的發(fā)病，EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜是一個共同的生物體，EMs婦女分泌期與增生期改變的缺失可能更有助于EMs患者子宮內(nèi)膜功能的受損、EMs內(nèi)膜功能紊亂與內(nèi)分泌的關(guān)系也進一步支持了包括在位內(nèi)膜在內(nèi)的改變可能是EMs的發(fā)病起源。

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Expression of activin A and inhibin A in endometriosis

Endometriosis ACTAINHAEutopic endometrium Ectopic endometrium

2013-02-18）

（本文編輯：沈昱平）

湖州市科技計劃資助項目（2011YS16）

313000 湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科（董婕、陳亞寧、王家建）；蘇州大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（沈宗姬）

董婕，E-mail:huzdj@hotmail.com