董婕 陳亞寧 王家建 沈宗姬

子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜激活素A、抑制素A的表達(dá)及意義

董婕 陳亞寧 王家建 沈宗姬

目的 探討激活素A（ACTA）、抑制素A（INHA）在子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）內(nèi)膜的表達(dá)及其臨床意義。方法收集30例EMS患者（EMS組）在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織，其中增生期16例，分泌期14例。同期正常子宮內(nèi)膜患者30例為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)兩組內(nèi)膜ACTA、INHA的表達(dá)；電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)兩組血清性激素E2、P水平。結(jié)果（1）EMS組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0．05）。（2）EMS組在位內(nèi)膜增生期、分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。（3）EMS組在位內(nèi)膜增生期、分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P水平均無(wú)相關(guān)性（均P＞0．05）。對(duì)照組增生期ACTA、INHA表達(dá)水平均與E2水平呈正相關(guān)（均P＜0．05）；對(duì)照組分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P水平均呈正相關(guān)（均P＜0．05）。結(jié)論ACTA、INHA在EMS表達(dá)增強(qiáng)，提示ACTA、INHA可能參與EMS的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥 激活素A 抑制素A 在位內(nèi)膜 異位內(nèi)膜

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of activin A(ACTA)and inhibin A(INHA)in endometriosis and its clinical significance．MethodsEutopic and ectopic endometrial tissues were collected from women with endometriosis(ectopic group, n=30),among which,sixteen samples were in proliferative phase and the other were in secretory phase．Normal endometrial tissues(control group,n=30)were collected from women without endometriosis．Immunohistochemistry(IHC)SP method was conducted to detect the expression of ACTAand INHA．Chemiluminescence assay was performed to measure the expression levels of estrogen (E2)and progestogen (P)in serum of these participants．ResultsThe expression of ACTAand INHAwas significantly higher in the ectopic and eutopic endomtria than that in the normal endometrium(both P＜0．05)．There was no significant difference in ACTAand INHAexpression between proliferative and secretory phase in eutopic endometrium(P＞0．05)．In the proliferative or secretory phase of eutopic group,neither ACTAnor INHAexpression was correlated with the level of E2and P(P＞0．05)．Positive correlation was shown between expression of ACTA,INHAand E2(P＜0．05)in the proliferative phase of control group;in secretory phase of control group,expressions of ACTAand INHAwere positively correlated with E2(P＜0．05)and P(P＜0．05)．Conclusion The present data suggest that the increased expressions of ACTAand INHAin the eutopic and ectopic endometria of endometriosis patients may participate in the pathogenesis and progression of endometriosis．

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）在育齡婦女有10%～15%的發(fā)病率[1]，近年來(lái)有明顯上升趨勢(shì)，主要引起不孕、痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、盆腔包塊、月經(jīng)異常等，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病變廣泛、形態(tài)多樣，極具侵襲和復(fù)發(fā)性，有諸多棘手問(wèn)題凾待解決。近年來(lái)，EMs基礎(chǔ)研究取得新進(jìn)展，提出了黏附、侵襲和血管形成的3A發(fā)病模式（attachment-aggrassion-angiogenesis），而這個(gè)模式需要多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用。激活素、抑制素是二聚體相關(guān)蛋白，不同的亞單位構(gòu)成激活素A（ACTA）和抑制素A（INHA），是多功能的多肽類細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)功能。本研究檢測(cè)了EMs患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中ACTA、INHA的表達(dá)，以探討其在EMs發(fā)病中可能的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2010-09—2011-11在湖州市婦幼保健院婦科收治經(jīng)病理確診的EMs患者30例，設(shè)為EMs組，年齡22～40（29.20±4.11）歲。取其在位內(nèi)膜（增生期16例，分泌期14例）及異位內(nèi)膜，根據(jù)1985年美國(guó)生育學(xué)會(huì)的EMs分期標(biāo)準(zhǔn)（r-AFS）進(jìn)行分期，均為III-IV期。取同期因單純輸卵管因素不孕行腹腔鏡檢查和卵巢畸胎瘤或輸卵管系膜囊腫行腹腔鏡手術(shù)的患者30例正常內(nèi)膜為對(duì)照組（增生期16例，分泌期14例），年齡22～34（27.83±3.09）歲。兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組婦女術(shù)前至少3個(gè)月未使用性激素，排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜病變及其他內(nèi)分泌、免疫、代謝性疾病、心、肝、腎疾??；兩組婦女月經(jīng)周期規(guī)則、經(jīng)量中等。增生期于月經(jīng)周期第8～11天進(jìn)行手術(shù)和采集標(biāo)本，分泌期于月經(jīng)周期第17～20天進(jìn)行手術(shù)和采集標(biāo)本。所有標(biāo)本按臨床倫理學(xué)要求在獲取前均征得患者同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集及處理 于手術(shù)日晨抽取兩組婦女空腹肘靜脈血5ml，立即2 000r/min離心15min，取上清液置-20℃冰箱待測(cè)E2、P。EMs組腹腔鏡手術(shù)時(shí)取卵巢EMs囊壁組織1cm×1cm×1cm大小，同時(shí)刮取子宮內(nèi)膜1cm×1cm×0.5cm大小，對(duì)照組腹腔鏡手術(shù)時(shí)刮取子宮內(nèi)膜1cm×1cm×0.5cm大小，均立即用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，作HE染色確認(rèn)月經(jīng)周期分期，同時(shí)作免疫組織化學(xué)（IHC）鏈霉素抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）法染色，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 IHC檢測(cè)ACTA、INHA的表達(dá) IHC試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。IHC操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參考Ota等[2]IHC評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)切片進(jìn)行盲式閱片，每張片子隨機(jī)選擇5個(gè)互不重疊的高倍視野，觀察所選擇的高倍鏡視野中的所有細(xì)胞，記錄染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度并計(jì)分。陰性：＜5%的細(xì)胞呈陽(yáng)性或者細(xì)胞顯色與背景一致，計(jì)0分；弱陽(yáng)性：5%～10%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，計(jì)1分；陽(yáng)性：11%～50%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，計(jì)2分；強(qiáng)陽(yáng)性：＞50%的細(xì)胞呈陽(yáng)性，計(jì)3分。細(xì)胞著色強(qiáng)度則以多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色計(jì)分：強(qiáng)著色：著色和已知陽(yáng)性片同樣強(qiáng)，計(jì)3分；淺著色：淺著色、但與陰性對(duì)照片有明顯區(qū)別者計(jì)1分；染色強(qiáng)度在淺著色和強(qiáng)著色之間者為中等著色，計(jì)2分；無(wú)著色：著色和陰性對(duì)照片相同計(jì)0分。將百分?jǐn)?shù)計(jì)分和細(xì)胞染色計(jì)分相加為IHC積分。

1.2.3 性激素測(cè)定 E2、P診斷試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。羅氏E170免疫測(cè)定分析儀采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定E2、P。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中表達(dá)定位 ACTA、INHA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的著色部位主要是在子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈淡黃色、深棕色或褐色，間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)也有少量表達(dá)，詳見(jiàn)圖1。

2.2 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 ACTA、INHA在內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較（IHC積分）

由表1可見(jiàn)，EMs組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達(dá)水平均強(qiáng)于對(duì)照組（均P＜0.05）；而EMs組在位內(nèi)膜ACTA、INHA表達(dá)水平與異位內(nèi)膜比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 ACTA、INHA在對(duì)照組正常內(nèi)膜、EMs組在位內(nèi)膜增生期、分泌期表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 ACTA、INHA在對(duì)照組正常內(nèi)膜、EMs組在位內(nèi)膜增生期、分泌期表達(dá)比較

由表2可見(jiàn)，對(duì)照組正常內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA的表達(dá)水平均強(qiáng)于增生期（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而EMs組在位內(nèi)膜增生期與分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。EMs組因異位內(nèi)膜與在位子宮內(nèi)膜周期并不同步，多表現(xiàn)為增生期改變，故未將異位內(nèi)膜進(jìn)行分期。

2.4兩組ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P的相關(guān)性分析 EMs組增生期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P水平均無(wú)相關(guān)性（r=0.133、0.235、-0.184、0.026，均P＞0.05）；EMs組分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P水平也均無(wú)相關(guān)性（r=0.279、0.016、0.148、0.048，均P＞0.05）。

對(duì)照組子宮內(nèi)膜增生期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2水平均呈正相關(guān)（r=0.526、0.609，均P＜0.05）而與P水平均無(wú)相關(guān)性（r=-0.185、-0.295，均P＞0.05）；對(duì)照組子宮內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA表達(dá)水平與E2、P水平均呈正相關(guān)（r=0.537、0.740、0.536、0.684，均P＜0.05）。

圖1 ACTA、INHA在子宮內(nèi)膜的表達(dá)（A：ACTA在正常子宮內(nèi)膜增生期的表達(dá)；B：INHA在正常子宮內(nèi)膜增生期的表達(dá)；C：ACTA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達(dá)；D：INHA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達(dá)；E：ACTA在EMs在位內(nèi)膜增生期的表達(dá)；F：INHA在EMs在位內(nèi)膜增生期的表達(dá)；G：ACTA在EMs在位內(nèi)膜分泌期的表達(dá)；H：INHA在EMs在位內(nèi)膜分泌期的表達(dá)；I：ACTA在EMs異位內(nèi)膜的表達(dá)；J：INHA在EMs異位內(nèi)膜的表達(dá)；SP染色，×400）

3 討論

子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生異位種植，需要經(jīng)過(guò)黏附、侵襲、血管形成的3A發(fā)病模式[3]。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的異常分泌參與組織重構(gòu)、血管再生和局部免疫反應(yīng)在其復(fù)雜的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ACT、INH則是產(chǎn)生于子宮內(nèi)膜并且可能是其中推定的一個(gè)因素。ACTA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖性、黏附性、侵襲性以及影響血管形成等生物學(xué)作用。INHA具有生長(zhǎng)因子樣作用，研究發(fā)現(xiàn)INH與ACT、TGF-β等都是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，具有自分泌、旁分泌生長(zhǎng)因子活性，參與細(xì)胞增殖、分化、免疫功能、細(xì)胞凋亡和組織重構(gòu)[4]。ACTA、INHA及其受體在子宮內(nèi)膜的存在增加了ACT、INH也能夠參與EMs發(fā)生的可能性[5]。本研究中正常子宮內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜均表達(dá)ACTA、INHA，并且在EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達(dá)增強(qiáng)。本文的研究結(jié)果結(jié)合近年來(lái)關(guān)于EMs的異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜能產(chǎn)生和分泌ACTA、INHA的報(bào)道[6-7]，支持了ACTA、INHA在EMs發(fā)生中可能的作用。

在EMs我們認(rèn)為ACTA可能對(duì)異常組織的重構(gòu)及與EMs有關(guān)的反應(yīng)相關(guān)，在其他組織ACTA的持續(xù)表達(dá)確實(shí)與纖維化相聯(lián)系。被Jones等[5]推測(cè)的子宮內(nèi)膜ACT的生理作用包括不同的功能如管理滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[8]和間質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化[9]。特別相關(guān)的ACT在EMs公認(rèn)的作用是觀察到ACT的出現(xiàn)是與包括子宮內(nèi)膜在內(nèi)[8-9]的各種組織的修復(fù)過(guò)程相聯(lián)系的。不僅ACTA調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)[9]和細(xì)胞外間質(zhì)部分的沉積[10]，而且ACTA似乎在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面扮演了一個(gè)重要的角色。進(jìn)一步的研究中在損傷調(diào)節(jié)和炎癥相關(guān)的疼痛中ACT與之相關(guān)[11]，ACTA增加了感覺(jué)神經(jīng)元對(duì)疼痛必要的神經(jīng)肽的表達(dá)，提示ACTA可能也是一個(gè)重要的EMs相關(guān)疼痛的調(diào)解者。而INHA的生長(zhǎng)因子樣作用有利于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞異常脫落逆流入盆腔后進(jìn)行增殖、分化，最終發(fā)展成EMs病灶。

本研究中，ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜分泌期的表達(dá)強(qiáng)于增生期，但在EMs婦女在位內(nèi)膜ACTA、INHA的表達(dá)在分泌期沒(méi)有增長(zhǎng)，與增生期的表達(dá)差異無(wú)顯著性，與Rocha等[12]的研究一致。健康婦女在分泌期ACTA、INHA表達(dá)增強(qiáng)這本身可能是內(nèi)膜成熟期內(nèi)的重要旁分泌信號(hào)，提示一個(gè)能接受的子宮內(nèi)膜信號(hào)[13-14]，這可能促進(jìn)了在胚胎著床時(shí)滋養(yǎng)層的侵入，我們推測(cè)EMs患者ACTA、INHA表達(dá)在在位內(nèi)膜分泌期與增生期改變的缺乏與雌激素的持續(xù)作用等內(nèi)分泌因素有關(guān)，并可能與EMs的不孕相關(guān)。EMs的病理改變包括盆腔解剖的變形、內(nèi)分泌和排卵的異常，在位子宮內(nèi)膜的激素和免疫細(xì)胞媒介功能的改變[12]。證據(jù)顯示子宮內(nèi)膜功能的紊亂也與此相關(guān)聯(lián)。局部表達(dá)的多肽類/蛋白質(zhì)參與對(duì)其他細(xì)胞類型的受分泌信號(hào)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的功能，他們的功能紊亂引發(fā)了EMs的病理情況。因此在EMs婦女分泌期與增生期改變的缺失可能更有助于EMs患者子宮內(nèi)膜功能的受損。

本研究發(fā)現(xiàn)在正常子宮內(nèi)膜增生期ACTA、INHA的表達(dá)與E2呈正相關(guān)，在正常子宮內(nèi)膜分泌期ACTA、INHA的表達(dá)與E2、P呈正相關(guān)。由此我們推測(cè)ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜的功能是通過(guò)與E2、P的作用來(lái)調(diào)節(jié)的，同時(shí)ACTA、INHA在正常子宮內(nèi)膜也是通過(guò)影響E2、P的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮其功能的。ACTA、INHA與E2、P的相關(guān)性提示在正常子宮內(nèi)膜腺體一個(gè)復(fù)雜的自分泌/旁分泌機(jī)制，并由這些物質(zhì)調(diào)節(jié)和控制。這同樣提示了在正常子宮內(nèi)膜ACTA、INHA復(fù)雜的自分泌/旁分泌機(jī)制，雖然ACTA、INHA的調(diào)節(jié)產(chǎn)生、新陳代謝、管理的生物合成機(jī)制的細(xì)節(jié)尚未完全闡明。而在EMs在位內(nèi)膜ACTA、INHA的表達(dá)與E2、P無(wú)相關(guān)關(guān)系，提示EMs內(nèi)膜功能紊亂與內(nèi)分泌的關(guān)系，但具體的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

EMs在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜ACTA、INHA表達(dá)的增強(qiáng)提示ACTA、INHA可能參與EMs的發(fā)病，EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜是一個(gè)共同的生物體，EMs婦女分泌期與增生期改變的缺失可能更有助于EMs患者子宮內(nèi)膜功能的受損、EMs內(nèi)膜功能紊亂與內(nèi)分泌的關(guān)系也進(jìn)一步支持了包括在位內(nèi)膜在內(nèi)的改變可能是EMs的發(fā)病起源。

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Expression of activin A and inhibin A in endometriosis

Endometriosis ACTAINHAEutopic endometrium Ectopic endometrium

2013-02-18）

（本文編輯：沈昱平）

湖州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011YS16）

313000 湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科（董婕、陳亞寧、王家建）；蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（沈宗姬）

董婕，E-mail:huzdj@hotmail.com