余潔 趙海嵐 吳苗琴

NGF對LASIK及Epi-LASIK術(shù)后角膜中TrkA受體表達作用的研究

余潔 趙海嵐 吳苗琴

目的 觀察兔眼準分子激光原位角膜磨鑲術(shù)（LASIK）及準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)（Epi-LASIK）術(shù)后局部點用神經(jīng)生長因子（NGF）后角膜組織中酪氨酸激酶受體A（TrkA）的表達情況，探索術(shù)后干眼癥的防治方法。方法將30只新西蘭純種兔，抽取15只30眼接受LASIK手術(shù)，余接受Epi-LASIK手術(shù)。術(shù)后每只兔子一眼滴NGF滴眼液，為實驗眼，對側(cè)眼滴0．9%氯化鈉溶液，為對照眼。1周后進行免疫組化分析，檢測角膜上皮細胞層以及角膜基質(zhì)層中TrkA的表達情況。結(jié)果觀察TrKA的表達，接受LASIK或Epi-LASIK手術(shù)后，滴用NGF滴眼液的眼均較對照眼強。LASIK組以及Epi-LASIK組滴用NGF眼兩者比較TrkA的表達無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論滴用NGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK術(shù)后TrkA受體表達均較高，可能有助于防治近視激光術(shù)后干眼癥。

神經(jīng)生長因子 酪氨酸激酶受體A 準分子激光原位角膜磨鑲術(shù) 準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù) 干眼癥

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of nerve growth factor(NGF)on the expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK．MethodsSixty eyes of 30 New Zealand white rabbits underwent LASIK or Epi-LASIK procedures with 30 eyes in each group．One eye,randomly selected in each rabbit was treated with topical NGF for 1 week,while the contralateral eye was treated with normal saline as control．The expression of NGF receptor(TrkA)on cornea was detected by histoimmunochemistry．ResultsThe expression of TrkA on the cornea treated with the topical NGF after LASIK or Epi-LASIK was stronger than that of control group．There was no difference in expression of TrkA between LASIK and Epi-LASIK groups． Conclusion Topical treatment of NGF can up-regulate the expression of TrkA in the cornea of rabbits after LASIK or Epi-LASIK．

隨著近視眼角膜屈光手術(shù)的廣泛開展，手術(shù)后干眼癥問題越來越受到重視。目前臨床上對干眼癥的治療主要局限在應(yīng)用人工淚液來緩解患者的干眼癥狀。由于人工淚液與正常淚液的成分相差甚遠，人工淚液的使用一般只能起到緩解眼干癥狀的作用，而無明顯的治療效果。由于在近視激光術(shù)后所產(chǎn)生的干眼癥，很大程度上與手術(shù)中切斷了角膜的感覺神經(jīng)有關(guān)[1-4]，因此如果能盡快修復(fù)神經(jīng)的損傷，改善角膜上皮的營養(yǎng)，可以很大程度上防止干眼癥的發(fā)生或縮短患者術(shù)后使用人工淚液的時間[5-6]。我們通過觀察兔眼準分子激光原位角膜磨鑲術(shù)（laser in situ keratomileusis，LASIK）及準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)（epipolis laser in situ keratomileusis，Epi-LASIK）術(shù)后局部點用神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）后角膜組織中酪氨酸激酶受體A（TrkA）表達的改變，旨在了解外源性NGF對LASIK及Epi-LASIK術(shù)后干眼癥可能的治療作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 LASIK動物模型眼的制備 取眼部檢查正常的健康新西蘭大耳白兔30只（由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，體重2～3 kg，雌雄兼?zhèn)?，普通級）。抽?5只30眼進行LASIK手術(shù)為LASIK組，另15只30眼進行Epi-LASIK手術(shù)為Epi-LASIK組。手術(shù)過程：用1%戊巴比妥鈉針注射麻醉（30mg/kg體重），麻醉起效后，用不透水塑料袋包裹動物，暴露頭部，剪掉眼瞼周圍較長睫毛，滴0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉2次。用無齒鑷和紋式鉗輕輕上提眼球至脫臼狀態(tài)，術(shù)中用紋式鉗在眼球后稍加固定（避免鉗夾視神經(jīng)），+2號負壓環(huán)（蘇州康明公司產(chǎn)品）固定環(huán)吸附眼球，Moria-M2角膜刀制作130μm厚角膜瓣（Epi-LASIK組制作110μm厚角膜瓣），掀開角膜瓣做激光切削（AllegrettoWave鷹視準分子激光機，切削直徑6 mm，切削量20μm），BSS液沖洗，LASIK組，角膜瓣復(fù)位縫線固定，Epi-LASIK組角膜瓣去瓣。

1.2 神經(jīng)生長因子滴眼液的配置與使用及分組 蘇肽生針劑（注射用鼠神經(jīng)生長因子，由舒泰神藥業(yè)有限公司惠贈），生物活性≥15 000Au（30μg）/支，為透明澄清水溶液，磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH值至7.3～7.5，過濾法除菌，分裝放入4℃冰箱中備用。自LASIK及Epi-LASIK術(shù)后第1天起，所有手術(shù)眼術(shù)后均點妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，抗炎及預(yù)防性抗感染治療，另外每只兔子右眼術(shù)后點用0.9%氯化鈉溶液配置的100μg/ml的NGF，4次/d，每次50μl，連續(xù)滴1周，對側(cè)眼滴用0.9%氯化鈉溶液，4次/d，每次50μl，連續(xù)滴1周。滴用NGF的兔眼為實驗眼，滴用0.9%氯化鈉溶液的兔眼為對照眼。

1.3 標本采集 在動物模型建立后及滴眼液使用過程中常規(guī)每日進行裂隙燈檢查。1周后，兔子均被靜脈注射空氣猝死，并立即在無菌條件下摘除眼球，剪除球結(jié)膜、筋膜、眼外肌、脂肪等結(jié)締組織，剪除視神經(jīng)。

1.4 免疫組化檢測 將眼球組織進行脫水及石蠟包埋，進行免疫組化分析，檢測角膜上皮細胞層以及角膜基質(zhì)層中NGF高親和力受體（TrkA）的表達情況。常規(guī)石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，高壓修復(fù)抗原3min、3%H2O2孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、10%正常羊血清室溫下封閉15min、滴加TrkA抗體（R&D Systems），4℃過夜，滴加生物素化二抗室溫孵育20min，PBS洗5min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素室溫孵育20min，PBS洗5min×3次，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。一抗工作濃度為1∶10，同時，以PBS代替一抗作為陰性對照。

每例角膜組織選一張切片，每張切片隨機選取角膜中央斷面區(qū)域角膜上皮細胞及其周圍約2cm×2cm大?。ǚ糯?00倍）范圍，用免疫組織化學(xué)圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）檢測其平均吸光度值作為該區(qū)域的TrKA的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，測得實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后滴用眼水1周免疫組化角膜組織TrkA表達 顯微鏡下觀察15只接受LASIK手術(shù)的新西蘭兔子30只眼球的角膜切片組織，均可發(fā)現(xiàn)角膜上皮細胞的胞質(zhì)顯示為棕黃色，但顯色強弱不一。實驗組的角膜上皮細胞胞質(zhì)顯色均強于自身對照眼。顯微鏡下觀察15只接受EPI-LASIK手術(shù)的新西蘭兔子30只眼球的角膜切片組織，同樣可發(fā)現(xiàn)角膜上皮細胞的胞質(zhì)顯示為棕黃色，但顯色強弱不一。實驗組的角膜上皮細胞胞質(zhì)顯色均強于自身對照眼（圖1）。

圖1 免疫組化染色檢測各組新西蘭純種兔術(shù)后角膜上皮細胞TrkA的表達（A：LASIK實驗眼；B：LASIK對照眼；C：Epi-LASIK實驗眼；D：Epi-LASIK對照眼；×400）

2.2角膜組織中TrkA免疫組化法檢測平均吸光度值比較 見表1。

表1 兩組實驗眼和對照眼TrKA平均吸光度值比較

由表1可見，LASIK組術(shù)后實驗眼平均吸光度值與其對照眼比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Epi-LASIK組術(shù)后實驗眼平均吸光度值與其對照眼比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。LASIK組實驗眼以及Epi-LASIK組實驗眼比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

準分子激光屈光手術(shù)近年來由于其有效性和安全性已被廣泛應(yīng)用，但其并發(fā)癥也引起了廣泛的重視。干眼癥是所有準分子激光手術(shù)后最常見的并發(fā)癥，也是造成術(shù)后患者不滿的常見原因。LASIK手術(shù)切斷了三叉神經(jīng)支配角膜的部分主干和分支，導(dǎo)致角膜的營養(yǎng)和觸覺的異常。Epi-LASIK雖然不損傷角膜神經(jīng)的主干，但制作角膜上皮瓣后切斷了神經(jīng)末梢，隨后的激光切削進一步損傷基質(zhì)層的神經(jīng)纖維，仍可導(dǎo)致術(shù)后干眼癥。

NGF作為人類發(fā)現(xiàn)的第一個生長因子，目前對其結(jié)構(gòu)功能以及作用機制有了較為清楚的了解，NGF具有保護效應(yīng)神經(jīng)元和促進神經(jīng)纖維生長的作用。一般認為神經(jīng)損傷后施萬細胞合成的NGF先與其膜上的低親和力受體（主要是p75）結(jié)合，當(dāng)再生軸突長入損傷遠側(cè)段或靶組織與施萬細胞接觸時，NGF從低親合力受體上脫落,轉(zhuǎn)而與再生軸突上的高親和力受體（主要是p140，TrkA）結(jié)合，NGF便由施萬細胞轉(zhuǎn)移到軸突，經(jīng)逆行運輸至效應(yīng)神經(jīng)元胞體后，與受體特異性結(jié)合，通過控制Na+-K+泵活動等復(fù)雜機制，保護軸突受損的神經(jīng)元存活，并促進蛋白質(zhì)及微絲微管生物合成以利軸突再生。

目前對NGF在眼表組織中的表達情況已進行了比較深入的研究。有研究表明在人類的角膜組織上皮細胞以及角膜基質(zhì)層中都可以檢測到NGF和相關(guān)受體TrkA的表達[7]，而國外已有一些研究表明，在PRK以及LASIK手術(shù)后短期內(nèi)淚液中的NGF濃度有比較明顯的上升[8]，說明在近視激光術(shù)后角膜傷口的愈合過程中NGF起著一定的作用，并且發(fā)現(xiàn)對兔眼進行LASIK術(shù)后使用NGF，可以提高角膜的敏感性[9]。對于一些實驗性的角膜上皮細胞缺損和角膜潰瘍，NGF有促進傷口修復(fù)的作用[10-11]，NGF能夠改善對于摘除動物的第三眼瞼后造成的干眼癥[12]等。所有這些信息表明近視激光術(shù)后外源性NGF的使用，可能會起到阻止干眼癥發(fā)生的作用。

由于檢測角膜上皮細胞層TrkA的表達情況，可以間接得知神經(jīng)生長的狀況。因此本實驗通過觀察比較LASIK或Epi-LASIK術(shù)后滴用NGF和0.9%氯化鈉溶液的兔眼角膜上皮細胞層TrkA的表達情況，從而間接推斷角膜神經(jīng)的生長情況。實驗證明：滴用濃度為100μg/mlNGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK術(shù)后角膜中TrkA受體表達水平明顯較滴用0.9%氯化鈉溶液的兔眼高，間接證明滴用外源性NGF，促進神經(jīng)再生，角膜的營養(yǎng)提供得到保障，推測干眼癥狀有可能得到較快緩解，因此推測外源性NGF對LASIK及Epi-LASIK術(shù)后發(fā)生的干眼癥可能起到一定的治療作用。但LASIK術(shù)后以及Epi-LASIK術(shù)后皆滴用外源性NGF，兩者TrkA的表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩種不同的手術(shù)方式術(shù)后滴用外源性NGF，對TrkA表達水平的影響相似。

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Effect of nerve growth factor on expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK

NGF TrkA LASIK Epi-LASIK Xeroma

2012-10-19）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2006A07）

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吳苗琴，E-mail：77janny@163.com