徐士勛 王咪娜 林錦旋 程亞濤 王艷慧 緒擴(kuò) 張宇忠 雷海民

目前酒精濫用已經(jīng)成為世界性的危害，長期大量飲酒對肝臟有直接毒害作用，從而引發(fā)酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)。在中國ALD發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人民健康[1]，酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[2]。

近年來中醫(yī)中藥防治酒精性肝病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究已有報道[3]，鱉甲作為一味常用的保肝、護(hù)肝良藥[4-6]，本課題組從醋炙鱉甲中分離獲得寡肽I-C-F-6，通過藥理研究證實(shí)該物質(zhì)對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有防護(hù)作用，初步推斷其機(jī)理可能與提升肝臟內(nèi)抗氧化酶谷胱甘肽還原酶及谷胱甘肽過氧化物酶與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性有關(guān)[7-8]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究報道，鱉甲對酒精引起的肝病也具有一定臨床應(yīng)用[9-10]，因此本實(shí)驗(yàn)探討了其對小鼠急性酒精性肝損傷的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)先注射給藥30天后以60%酒精灌胃3次誘導(dǎo)建立小鼠急性肝損傷模型，考察各實(shí)驗(yàn)組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)酶含量及肝臟SOD活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及肝組織病理學(xué)檢查，觀察并分析評價鱉甲寡肽化合物I-C-F-6防治酒精致小鼠急性肝損傷效果，深入研究了該化合物的肝保護(hù)作用，為寡肽I-C-F-6用于臨床防治酒精性肝病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性ICR小鼠18～20 g，北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物和試劑

鱉甲寡肽I-C-F-6(序列：GAGPHGG，純度大于98%)，實(shí)驗(yàn)室從醋炙鱉甲中分離純化確證結(jié)構(gòu)，委托上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?。乙醇，生理鹽水，雙蒸水。ALT試劑盒、AST試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，其它試劑均為國產(chǎn)分析純，均購自北京化工廠。

1.3 儀器

萬分之一分析天平(上海分析儀器廠)；TDL-5-A CENTRZFUGE 高速離心機(jī)(飛鴿牌)；DK-98-I 型恒溫水浴鍋；注射器(常州悅康醫(yī)療器械有限公司)；RM2015 組織切片機(jī)( Leicainstruments Ltd. )；Nikon ECLIPSE90i顯微鏡。

1.4 動物分組

雄性ICR小鼠48只,體重(18±2) g，隨機(jī)分為5組：正常對照組8只，模型組10只，寡肽低劑量、寡肽高劑量組各10只，陽性藥組10只，實(shí)驗(yàn)過程中無動物死亡。

1.5 給藥與造模

動物適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，正常對照組和模型組均按0.12 ml·kg-1劑量皮下注射生理鹽水，每天1次；寡肽低劑量組和寡肽高劑量組分別以0.32 mg·kg-1和0.64 mg·kg-1濃度，按0.12 ml·kg-1劑量皮下注射寡肽的生理鹽水溶液；陽性藥組以240.00 mg·kg-1濃度按0.12 ml·kg-1劑量灌胃還原型谷胱甘肽，連續(xù)30天。30天后，除正常對照組以0.12 ml·kg-1劑量灌胃生理鹽水外，其余組均以0.12 ml·kg-1劑量灌胃60%乙醇3次(10小時/次)。

1.6 取材

第30天給藥結(jié)束后，連續(xù)3次灌胃60%酒精后(10小時/次)，最后一次禁食不禁水12小時，小鼠摘取眼球取血后，分離血清，-20 ℃保存待檢；小鼠取血處死后，打開腹腔，觀察肝臟色質(zhì)形態(tài)等情況，從肝右葉切取1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小肝組織一塊做蘇木精—伊紅染色，取肝左葉1.0 g，制備10%的肝勻漿待檢。

1.7 觀測指標(biāo)

小鼠行為學(xué)狀態(tài)：小鼠飲食量、毛發(fā)光澤、體重、糞便狀態(tài)、醉酒狀態(tài)。

小鼠肝體指數(shù)：稱量小鼠體重及肝重，記錄后以肝臟質(zhì)量除以體重，得到小鼠的肝體指數(shù)。

血清ALT、AST測定：按試劑盒說明書步驟操作檢測血清ALT，AST活性。

肝組織MDA、SOD的測定：按試劑盒說明書步驟操作檢測肝臟MDA, SOD水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重及外觀行為變化

模型組小鼠毛質(zhì)粗糙，厭食，精神萎靡，動作遲緩，體重明顯減輕，解剖肝臟花斑樣改變，蒼白、質(zhì)硬，有的有腹腔積液；給藥組有所改善。實(shí)驗(yàn)過程中，模型組小鼠無死亡現(xiàn)象。

2.2 小鼠血清ALT、AST比較

與正常對照組相比，模型組血清ALT、AST的活性含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，寡肽組和陽性藥組血清ALT、AST含量明顯降低(P<0.05)；與寡肽組相比，陽性藥組血清ALT、AST的含量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 寡肽I-C-F-6對酒精所致急性肝損

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與模型組相比，cP<0.05。

2.3 小鼠肝臟肝體指數(shù)、SOD、MDA比較

與正常對照組相比，模型組肝勻漿SOD活力顯著降低、MDA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組

相比，寡肽組和陽性藥組肝勻漿SOD活力顯著升高、MDA含量明顯降低(P<0.05)；與寡肽組相比，陽性藥組肝勻漿SOD活力顯著升高、MDA含量明顯降低(P<0.05)；見表2。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

HE染色后，電鏡下觀察，正常對照組對照肝細(xì)胞核深染，胞漿較大，胞質(zhì)均勻(A)。模型組肝細(xì)胞中央靜脈周圍存在碎片狀肝細(xì)胞壞死，部分肝細(xì)胞核溶解消失，有充血現(xiàn)象(B)。寡肽低劑量組肝細(xì)胞水腫范圍較大，出現(xiàn)肝細(xì)胞空泡(C)。寡肽高劑量組肝細(xì)胞水腫較輕(D)。陽性藥組肝部分肝細(xì)胞侵潤，肝細(xì)胞正常范圍多(E)。見圖1。

A

B

C

D

EA 正常對照組；B 模型組；C 寡肽低劑量組(0.32 mg·kg-1)；D 寡肽高劑量組(0.64 mg·kg-1)；E 陽性藥組(240 mg·kg-1)圖1 小鼠肝組織病理學(xué)檢查(HE染色 ×400)

組別n給藥濃度(mg·kg-1)SOD(U·ml-1)MDA(nmol·ml-1)肝體指數(shù)正常對照組8-60.44±5.441.82±0.290.050±0.0033模型組10-45.37±8.55a4.54±1.48a0.059±0.0034寡肽低劑量組100.3257.59±2.58b2.05±0.35b0.052±0.0038寡肽高劑量組100.6454.94±3.55b1.91±0.58b0.050±0.0037陽性藥組10240.00 58.01±14.95c 2.01±0.22c0.049±0.0029

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與模型組相比，cP<0.05。

3 討論

酒精吸收入血后，90%以上主要在肝臟代謝，其肝損傷機(jī)制主要有乙醇的直接毒性、乙醇氧化成乙醛導(dǎo)致的化學(xué)性損傷、氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等，可損害肝臟各種細(xì)胞器和酶的結(jié)構(gòu)功能[11]。

ALT和AST是用于診斷肝實(shí)質(zhì)損害的主要酶類，是肝損傷的主要指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞被破壞、細(xì)胞膜通透性增高及線粒體損傷時，ALT和AST被釋放到血液中，使之明顯升高[12]；自由基引起的氧化損傷被認(rèn)為是酒精性肝損傷的重要病理機(jī)制[13]，它可以激活氧分子產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化[14-15]，其中SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[16]；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，它既能反映機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)，也能作為機(jī)體損傷的損害因子[17]。

還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，能參與體內(nèi)氧化還原過程，和過氧化物及自由基本結(jié)合對抗氧化劑對巰基的破壞，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，臨床上常應(yīng)用于肝臟疾病[18]。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)模型組的肝體指數(shù)最大，可能是酒精對肝組織造成了影響，使肝臟腫脹、膨大，造成了一定的肝損傷；由血清指標(biāo)及肝臟指標(biāo)的統(tǒng)計比較可見，模型組小鼠血清指標(biāo)ALT、AST及肝臟MDA較正常對照組有顯著升高，肝臟SOD活力明顯降低；而給予寡肽藥物的兩個劑量組肝功能指標(biāo)均有不同程度的改善，其中寡肽高劑量組在對ALT、AST、MDA的抑制作用方面和SOD活力升高方面尤其明顯，陽性藥組則優(yōu)于寡肽組。肝組織HE染色后的形態(tài)學(xué)觀察亦說明，寡肽I-C-F-6可改善酒精導(dǎo)致的急性肝損傷；由此說明鱉甲寡肽I-C-F-6對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有較好的預(yù)防保護(hù)作用。

由鱉甲寡肽I-C-F-6可以升高肝臟SOD酶活力和降低MDA含量可以說明其酒精性肝損傷保護(hù)機(jī)制可能是通過抗自由基及脂質(zhì)過氧化而實(shí)現(xiàn)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)所用藥物鱉甲寡肽I-C-F-6是一種由7個L-氨基酸組成的具有全新結(jié)構(gòu)的小肽化合物，其分子量小于1000，與蛋白質(zhì)相比，小分子肽的抗原性小，不易引起過敏反應(yīng)，而且還具有很好的溶解性，在體內(nèi)吸收快、利用率高，因此更有利于發(fā)揮藥效。以上研究表明，鱉甲寡肽化合物I-C-F-6在防治酒精誘導(dǎo)形成的小鼠急性肝損傷方面有著較為顯著作用，具有保護(hù)肝細(xì)胞作用，為后續(xù)先導(dǎo)化合物的開發(fā)和研究奠定基礎(chǔ)，為后期臨床研究提供一定的參考依據(jù)。

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