賴 樂(lè)，莫紅纓，賴春麗

(廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510120)

銀杏酮酯(GBE50)是從銀杏葉中提取、精制而成，經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)正式生產(chǎn)的二類中藥新藥，主要成分是黃酮醇苷與萜類內(nèi)酯，臨床主要用于預(yù)防和治療心腦血管疾病，但由于口服吸收差，影響臨床應(yīng)用，而磷脂復(fù)合物中的磷脂分子具有兩親性可作為有效的乳化劑，也是細(xì)胞膜的重要組成部分，因此，制備成銀杏酮酯磷脂復(fù)合物，通過(guò)改善腸透過(guò)性能，為提高口服吸收利用度提供可能。體外擴(kuò)散池法被國(guó)外學(xué)者譽(yù)為胃腸道屏障功能研究的金標(biāo)準(zhǔn)，在研究藥物的腸吸收和代謝方面已有一定的應(yīng)用，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)法或分光光度法測(cè)定藥物的透過(guò)量后，根據(jù)藥物的有效滲透系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)藥物吸收的動(dòng)力學(xué)的變化，可用于研究藥物在特定腸段的吸收，模擬腸道的生理環(huán)境，操作方便簡(jiǎn)單。本研究中的體外擴(kuò)散池法試驗(yàn)是建立在大鼠腸黏膜基礎(chǔ)上的，是用來(lái)預(yù)測(cè)銀杏酮酯中的黃酮醇苷在人體的吸收，對(duì)銀杏酮酯原料和銀杏酮酯磷脂復(fù)合物進(jìn)行體外初步評(píng)價(jià)，為提高銀杏酮酯磷脂復(fù)合物在體內(nèi)的生物利用度提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

LC-20A型系列高效液相色譜儀(日本島津公司);7 mL Ussing Chamber裝置(美國(guó) Harvard公司);Model-868型 pH計(jì)(Thermo Orion);電子分析天平(sarorius，d=0．1 mg)。戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑廠);銀杏酮酯(GBE50，上海杏靈科技藥業(yè)公司，批號(hào)為061202);大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20072101017);四氫呋喃(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)為030901-2);甲醇為色譜純;槲皮素對(duì)照品(批號(hào)為100081-200406)、山柰素對(duì)照品(批號(hào)為110861-200606)、異鼠李素對(duì)照品(批號(hào)為110860-20046)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;磷酸(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)為20071003)。SD 大鼠[♂，250～280 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(粵)2006-0015]。

1．2 方法

1．2．1 銀杏酮酯磷脂復(fù)合物的制備

按1∶1質(zhì)量比稱取銀杏酮酯與大豆磷脂適量，溶于四氫呋喃中，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)物質(zhì)(銀杏酮酯)的濃度為20 g/L，反應(yīng)6 h后，40℃真空干燥去掉反應(yīng)溶劑，用二氯甲烷洗滌未反應(yīng)的原料，40℃真空干燥去掉二氯甲烷后，即得。

1．2．2 Hepes-Tris緩沖液的制備

精密稱取Hepes 3．0 g，加入400 mL蒸餾水，攪拌使之完全溶解，通入混合氣體(95%O2∶5%CO2)10 min后，加入 0．9 mL KCl(3 mol/L)，0．9 mL CaCl2(1 mol/L)，0．4 mL MgSO4(1 mol/L)和4．09 g NaCl，充分?jǐn)嚢柰耆芙夂?，用Tris液(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至7．4，加入 2．5 mL 葡萄糖(1 mol/L)，加入蒸餾水定容至 500 mL。

1．2．3 藥物溶液的制備

由同一名口腔醫(yī)生采用精度為0.01 mm的電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(深圳佳林)測(cè)量第一前磨牙的全牙長(zhǎng)、冠長(zhǎng)、根長(zhǎng)、冠近遠(yuǎn)中徑、冠唇(頰)舌徑、頸近遠(yuǎn)中徑和頸唇(頰)舌徑，每個(gè)數(shù)據(jù)測(cè)量3次，取平均值。肉眼觀察并記錄各牙根數(shù)目，其中雙根型包括根分叉位于根上、根中、根尖1/3處，且有獨(dú)立根尖孔。

GBE50原料溶液:稱取0．05 g GBE50溶于1 mL乙醇中，再取 0．5 mL用 Hepes-tris緩沖液定容至 50 mL作為供試液，GBE50的最終質(zhì)量濃度為0．5 g/L。

GBE50磷脂復(fù)合物溶液:稱取0．103 g GBE50磷脂復(fù)合物(相當(dāng)于 GBE50 0．05 g)溶于 1 mL乙醇中，再取 0．5 mL用 Hepes-tris緩沖液定容至50 mL作為供試液，GBE50的最終質(zhì)量濃度為 0．5 g/L。

杏靈顆粒溶液:稱取0．625 g杏靈顆粒(1 g∶40 mg GBE50，相當(dāng)GBE50 0．025 g)溶于0．5 mL乙醇，用 Hepes-tris緩沖液定容至50 mL作為供試液，GBE50的最終質(zhì)量濃度為0．5 g/L。

1．2．4 體外擴(kuò)散池法

選取SD大鼠禁食16～19 h，3%戊巴比妥鈉(32 mg/kg)腹腔注射麻醉，沿腹中線將腹部切開2．5 cm左右，胃下5 cm處為空腸(約10 cm)，在空腸前端插入硅膠管(內(nèi)徑2 mm)結(jié)扎，空腸末端剪開一小口后，輕緩地用0．9%氯化鈉注射液沖洗干凈，分離空腸置HEPES緩沖液中，冰浴培養(yǎng)5 min，剪取3～4 cm長(zhǎng)的腸段，迅速分離筋膜層，將腸黏膜固定于擴(kuò)散池上。黏膜側(cè)加入37．5℃試驗(yàn)用藥物7 mL，漿膜側(cè)加入等體積同溫度的HEPES緩沖液;在混合氣體(95%O2∶5%CO2)的作用及37．5℃水浴保溫下，分別于 15，30，45，60，75，90，120 min 時(shí)在接收側(cè)取樣 0．5 mL，同時(shí)補(bǔ)充0．5 mL緩沖液。

1．2．5 銀杏酮酯中黃酮醇苷的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別取在五氧化二磷減壓干燥器中放置過(guò)夜的對(duì)照品槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品適量，用甲醇溶解配制不同質(zhì)量濃度，槲皮素質(zhì)量濃度分別為 12．5，25，50，100，200 ng/mL，山柰素質(zhì)量濃度分別為 8．75，17．5，35，70，140 ng/mL，異鼠李素質(zhì)量濃度分別為 8．75，17．5，35，70，140 ng/mL。分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(X軸為質(zhì)量濃度，g/L，Y軸為峰面積)，得回歸方程，槲皮素為 Y=117．09X ＋324．94(R2=0．998 3);山柰素為Y=52．528 X ＋48．783(R2=0．999 9);異 鼠 李 素 為 Y=49．93 X ＋34．5(R2=0．999 5)。

空白干擾試驗(yàn):取不含任何藥液的透過(guò)液按2．5．2項(xiàng)下方法處理，由于透過(guò)液在368 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，因此不會(huì)對(duì)透過(guò)液中黃酮醇苷的測(cè)定產(chǎn)生干擾，見圖1。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理

將高效液相色譜法測(cè)得的數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度(Ctn)，用下列公式計(jì)算累計(jì)樣體積和加入藥液量，單位為L(zhǎng)。根據(jù)給藥劑量 D，計(jì)算累計(jì)透過(guò)率:Qtn/D×100%。表觀滲透系數(shù)(Papp)是表示藥物經(jīng)黏膜透過(guò)能力的重要指標(biāo)，其計(jì)算公式為:Papp=(dQ/dt)×(1/AC0)，其中dQ/dt表示穩(wěn)態(tài)時(shí)時(shí)間，累計(jì)透過(guò)量線性回歸所得的斜率，A為有效滲透面積1．78 cm2，C0為加入藥液時(shí)初始藥物濃度。

2 結(jié)果

2．1 最佳區(qū)段腸的選擇

圖1 高效液相色譜圖

分別選擇十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸作比較，以各區(qū)段腸的累計(jì)透過(guò)率與時(shí)間作圖，詳見圖2，而表觀滲透系數(shù)比較見表1。用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各區(qū)段腸間的表觀滲透系數(shù)進(jìn)行組間one-way ANOVA分析，多重比較采用LSD法，各區(qū)段腸的表觀滲透系數(shù)比較結(jié)果，十二指腸的Papp與其他3組相比都有顯著性差異，空腸與回腸和結(jié)腸相比也有顯著差異。Papp是評(píng)價(jià)透過(guò)性能的重要指標(biāo)，說(shuō)明十二指腸的透過(guò)性能最好，空腸次之，但由于藥物在十二指腸的停留時(shí)間較短，則選用空腸為最佳區(qū)段腸。

圖2 GBE50體外擴(kuò)散池法試驗(yàn)透過(guò)圖(n=3，X±s)

表1 GBE50在各區(qū)段腸的表觀滲透系數(shù)

2．2 藥物組間比較

分別取藥液銀杏酮酯原料藥、銀杏酮酯磷脂復(fù)合物和陽(yáng)性對(duì)照藥(杏靈顆粒)并比較三者在空腸的透過(guò)性能，以累計(jì)透過(guò)率與時(shí)間作圖，詳見圖3，表觀滲透系數(shù)比較見表2。用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組間的表觀滲透系數(shù)進(jìn)行組間one-way ANOVA分析，多重比較采用LSD法，各組的表觀滲透系數(shù)比較結(jié)果，與GBE50原料組比較，GBE50磷脂復(fù)合物組與陽(yáng)性對(duì)照組均有顯著差異，且均有提高;陽(yáng)性對(duì)照與GBE50磷脂復(fù)合物比較，也有顯著差異，Papp也有提高，透過(guò)性能也有所改善。

圖3 GBE50體外擴(kuò)散池法試驗(yàn)透過(guò)曲線圖(n=3，X±s)

表2 GBE50在空腸的表觀滲透系數(shù)

3 討論

體外擴(kuò)散池法用來(lái)評(píng)價(jià)銀杏酮酯磷脂復(fù)合物的透過(guò)性能，用高效液相法測(cè)定腸黏膜通過(guò)的黃酮醇苷的量，該方法靈敏度較高，重現(xiàn)性較好，而且該方法測(cè)定黃酮醇苷比較成熟，因此，選擇用高效液相色譜法測(cè)定黃酮醇苷的含量作為評(píng)價(jià)透過(guò)性能的指標(biāo)。

在體外擴(kuò)散池試驗(yàn)中要注意控溫和通氣，防止腸變性，氧化，失去正?；钚?，在選擇溶劑時(shí)，用乙醇作為助溶劑能使藥物更好地溶解，但乙醇的濃度不超過(guò)1%，以防止破壞腸的活性，且要保證各溶液的乙醇的濃度一致，以減少誤差。

在選擇最佳區(qū)段腸時(shí)，選取了十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸進(jìn)行透過(guò)性能的比較，結(jié)果十二指腸較其他區(qū)段腸透過(guò)性能都好(P＜0．01)，但由于藥物在十二指腸的停留時(shí)間較短，因此選擇此腸段沒(méi)有實(shí)際意義，而黃酮醇苷在空腸的透過(guò)性能僅次于十二指腸，較其他腸段(回腸，結(jié)腸)透過(guò)性能好(P＜0．01)，因此最后選擇空腸為最佳評(píng)價(jià)腸段。

體外擴(kuò)散池法試驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏酮酯磷脂復(fù)合物的透過(guò)性能較其他兩組都有所改善(P＜0．01)，可能原因?yàn)殂y杏酮酯磷脂復(fù)合物的脂溶性增加，改善了溶解性能和黏膜透過(guò)性能，從而增加了腸透過(guò)性能。

至今為止，超過(guò)60%的藥物為口服制劑，因此預(yù)測(cè)藥物經(jīng)胃腸道黏膜吸收在設(shè)計(jì)口服給藥劑型非常重要并具有實(shí)際價(jià)值[3]。Watanabe等[4]通過(guò)體外擴(kuò)散池法試驗(yàn)對(duì)15種水溶性和脂溶性的藥物表觀滲透系數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并與人體內(nèi)吸收分?jǐn)?shù)(Fa)比較相關(guān)性，結(jié)果表明Papp與Fa之間存在良好的相關(guān)性。本研究對(duì)銀杏酮酯磷脂復(fù)合物、銀杏酮酯原料與杏靈顆粒的Papp進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果相比其他兩組，銀杏酮酯磷脂復(fù)合物的Papp有所增加，表明銀杏酮酯制備成磷脂復(fù)合物后，有可能提高人體內(nèi)的吸收度，從而提高生物利用度。

[1]賴 樂(lè)，賴春麗，趙建彬，等．銀杏酮酯磷脂復(fù)合物的制備與理化性質(zhì)的研究[J]．中藥材，2010，33(10):1 624-1 628．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:220-221．

[3]李國(guó)峰，王春霞，晏 媛，等．體外擴(kuò)散池法評(píng)價(jià)瑞巴派特經(jīng)大鼠腸黏膜的透過(guò)特性[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(3):314-317．

[4]Watanabe E，Takahashi M，Hayashi M．A possibility to predict the absorbability of poorly water-soluble drugs in humans based on rat intestinal permeability assessed by an in vitro chamber method[J]．Eur J Pharm Biopharm，2004，58:659-665．