章 剛，黃德新，駱曉棟

(深圳大學(xué)生化工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518057)

梅毒是臨床上常見(jiàn)的性傳播疾病，迄今為止尚未分離出具有保護(hù)性免疫力的抗體，也無(wú)有效的疫苗，因此梅毒螺旋體相關(guān)抗原的制備，對(duì)于疾病的早期診斷和治療，防止血液傳播等顯得尤為重要[1]。用基因工程方法表達(dá)的重組抗原易于生產(chǎn)、純化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化控制。TpN47是應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法從梅毒螺旋體全基因組中擴(kuò)增膜蛋白的一個(gè)片段，克隆到載體pET-HT-JKM中，在BL21(DE3)plysS菌中誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為47×103，理論等電點(diǎn)為5．81。該蛋白以包涵體的形式存在于表達(dá)菌體中，N端含有六聯(lián)組氨酸標(biāo)記，因此可先將包涵體溶解于含有高濃度變性劑的緩沖液中，再進(jìn)行固定化金屬親和層析(IMAC)[2]分離純化該蛋白。蛋白質(zhì)一般都是在相對(duì)溫和的天然條件下行使其功能，用于建立雙抗原夾心試劑的抗原蛋白必須首先能溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。因此，變性條件下層析純化的蛋白質(zhì)必然涉及到蛋白質(zhì)的復(fù)性問(wèn)題，以解決其溶解性。實(shí)際應(yīng)用中，可以采用兩種方式進(jìn)行復(fù)性，一種是在變性條件下洗脫結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行透析或稀釋復(fù)性，另一種是蛋白結(jié)合在柱上之后，用相對(duì)溫和的溶液環(huán)境頂替變性溶液環(huán)境，待蛋白復(fù)性后再進(jìn)行洗脫操作[3-4]。

1 材料與儀器

Urea，NaCl，NiSO4，Imidazol 均 為 國(guó) 產(chǎn) 分 析 純 試 劑;Protein Molecular Weight Marker購(gòu)自 Amersham;Tris，β-ME 及 SDSPAGE相關(guān)試劑均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。電泳儀(Bio-Rad公司);層析系統(tǒng)(安瑪西亞公司AKTA Explorer)，層析介質(zhì)為Chelating Sepharose Fastflow;離心機(jī)為Hitach高速冷凍離心機(jī) CR22F;超聲破碎儀(SONICS＆MATERIALS INC．)。收集的TpN47表達(dá)菌體經(jīng)超聲破菌并離心分離后，得到本研究所需的包涵體。

2 方法與結(jié)果

2．1 緩沖液的配制

平 衡 緩 沖 液 A:8 M 尿 素 ，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH=8．5;復(fù)性緩沖液 B:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH=8．5;去雜緩沖液 C:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，0．04 M 咪唑，pH=8．5;洗脫緩沖液 D:2 M 尿素，0．3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，0．25 M 咪唑，pH=8．5。

2．2 層析樣品液的制備

以30∶1(V/W)的比例用平衡緩沖液A 150 mL懸起5 g包涵體，并補(bǔ)加10 mM β-ME于混懸液中，調(diào)溶液pH至8．5，室溫下磁力攪拌作用240 min后，19 000 r/min離心15 min，所得上清液即為層析樣品液。

2．3 TpN47 的純化

層析柱XK16/20，層析介質(zhì)為Chelating Sepharose FF，取25 mL按要求進(jìn)行處理。將已制備的層析樣品液分作2份，其中1份體積為100 mL，另1份為50 mL。層析過(guò)程檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。填料裝柱后依次用10個(gè)柱體積純水、0．5個(gè)柱體積的0．1 M NiSO4、3個(gè)柱體積純水流過(guò)層析柱，接著用5個(gè)柱體積平衡緩沖液A平衡柱子待用。分別對(duì)2份層析樣品液進(jìn)行如下層析操作:上樣，以平衡緩沖液沖洗2個(gè)柱體積，用2個(gè)柱體積復(fù)性緩沖液平衡層析柱，使變性蛋白柱上復(fù)性，接著用4個(gè)柱體積去雜緩沖液除去雜質(zhì)，最后用3個(gè)柱體積洗脫緩沖液洗脫，緊接著用平衡緩沖液A沖洗柱子，再用洗脫緩沖液D沖洗柱子。收集以上各環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行SDS-PAGE的分析。

2．4 層析圖譜

100 mL層析樣品液的層析圖譜及SDS-PAGE分別見(jiàn)圖1及圖2，50 mL層析樣品液的層析圖譜及SDS-PAGE分別見(jiàn)圖3及圖4。

圖1 IMAC層析圖譜(100 mL上樣量)

圖2 IMAC層析(100 mL上樣量)組分的SDS-PAGE分析

圖3 IMAC層析圖譜(50 mL上樣量)

圖4 IMAC層析(50 mL上樣量)組分SDS-PAGE分析

3 討論

蛋白質(zhì)復(fù)性是應(yīng)用基因重組技術(shù)在菌體中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的瓶頸。蛋白質(zhì)復(fù)性是一個(gè)過(guò)程，存在中間階段，此階段的各種相互作用決定了蛋白質(zhì)能否復(fù)性。蛋白質(zhì)復(fù)性要求有一定的條件，如pH、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度等。另外，多種添加劑能促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性，其中包括表面活性劑、低濃度變性劑、分子伴侶蛋白和各種氧化還原劑等。由于純化目的是得到較高純度的蛋白，添加劑的使用可能有助于蛋白質(zhì)復(fù)性，但在最終產(chǎn)品中必須去除。為了不引入新的雜質(zhì)，本研究根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)采用柱上復(fù)性的方法，即蛋白結(jié)合在柱上之后，用相對(duì)溫和的溶液環(huán)境頂替變性溶液環(huán)境，待蛋白質(zhì)復(fù)性后再進(jìn)行洗脫，取得了良好的結(jié)果。

常規(guī)層析操作的完整流程是平衡、上樣、淋洗、洗脫、再生，然后可進(jìn)入下一個(gè)操作循環(huán)。對(duì)于IMAC，在除雜操作之后，250 mM的咪唑緩沖液足以洗脫特異性結(jié)合蛋白，通常不需要額外的再生操作，只是在經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)操作循環(huán)之后，柱載量明顯下降時(shí)才進(jìn)行徹底的再生操作，即用EDTA絡(luò)合緩沖液除去基質(zhì)結(jié)合的金屬離子，徹底清洗基質(zhì)后，再重新結(jié)合上金屬離子。本試驗(yàn)層析純化出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象，由圖1可知，在250 mM的咪唑緩沖液洗脫操作結(jié)束后，用平衡緩沖液A平衡柱子的過(guò)程中出現(xiàn)了一個(gè)大的平衡緩沖液洗脫峰(2)，這是常規(guī)層析操作中少有的現(xiàn)象。SDSPAGE分析平衡緩沖液A平衡柱子過(guò)程中出現(xiàn)的洗脫峰(2)表明其主要成分為目標(biāo)蛋白。上樣完畢后緩沖液A的淋洗沒(méi)有出現(xiàn)洗脫峰，而在洗脫液D洗脫特異性結(jié)合蛋白后緊接著再用A液洗柱出現(xiàn)較大的洗脫峰(2)，說(shuō)明此時(shí)被洗脫的結(jié)合蛋白是在洗脫液D洗脫時(shí)由于某種原因滯留在層析柱中，而且這種滯留蛋白不是與介質(zhì)發(fā)生該層析過(guò)程所應(yīng)有的特異性結(jié)合，而是在金屬螯合以外作用力之下吸附在柱上。滯留蛋白產(chǎn)生的原因可能是洗脫液D條件下洗脫蛋白的局部過(guò)濃導(dǎo)致部分蛋白以固體形式析出，也有可能是柱上復(fù)性過(guò)程中產(chǎn)生了不溶性產(chǎn)物，具體成因尚待進(jìn)一步研究。當(dāng)緩沖液A流經(jīng)柱子時(shí)，在緩沖液A中高濃度尿素作用下析出蛋白又重新溶解并解吸附，由于緩沖液A中沒(méi)有咪唑等頂替劑，重新溶解的蛋白其中一部分又能與層析介質(zhì)上的金屬離子結(jié)合，從而再次結(jié)合在柱上。另一部分蛋白由于受蛋白溶解動(dòng)力學(xué)以及與金屬離子的結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)限制，不能與介質(zhì)有效結(jié)合因而流出柱子形成吸收峰。流出柱子的蛋白量的多少取決于柱中滯留蛋白的多少，而這在一定范圍內(nèi)與上樣量呈正相關(guān)，這一點(diǎn)在減少上樣量后得到了初步驗(yàn)證?；谝陨戏治?，在出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，即在洗脫液D洗脫特異性結(jié)合蛋白后緊接著再用A液洗柱出現(xiàn)較大的洗脫峰時(shí)，改變常規(guī)操作，用洗脫液D洗脫液再次洗脫，可得到較為可觀的目標(biāo)組分，從而在不增加上樣次數(shù)的情況下提高了目標(biāo)產(chǎn)物的收率。

本研究結(jié)果在其他蛋白質(zhì)變性條件下金屬螯合親和層析純化中得到了較好的應(yīng)用，對(duì)于變性條件下其他吸附性色譜純化蛋白的研究也可能具有一定的參考價(jià)值。

[1]盧海蓉，王曉紅，陳少娟，等．梅毒螺旋體重組抗原的表達(dá)及在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用[J]．中國(guó)生物工程雜志，2009，29(6):41-45．

[2]Porath．Amino acid side chain interaction with chelate-ligand crosslinked dextran，agrose and TSK gel．A minireview of recent work[J]．Mol Recogn，1990，3:123-127．

[3]谷振宇，蘇志國(guó)．蛋白質(zhì)的層析折疊復(fù)性[J]．化工學(xué)報(bào)，2000，51(S1):325-329．

[4]王 穎，董曉燕，孫 彥．蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展[J]．生物工程進(jìn)展，2002，22(2):61-65．