隆獻　何澤云　周艷利　羅寅亮　李巖巖　徐文峰　李旭華

腎間質纖維化以細胞外基質在腎間質過量積聚、腎臟組織結構破壞及功能喪失為特征，是多種慢性腎臟疾病走向腎功能衰竭的主要病理改變。其發(fā)病機制通常認為與上皮細胞轉分化、炎癥反應、細胞凋亡及多種細胞因子的共同作用等有關。近年來HGF作為一種具有負性調控腎纖維化效應的腎臟保護因子得到了廣泛關注[1]。

以往研究顯示，六味地黃丸能促進5/6腎切除大鼠殘腎腎小球化生、延緩腎切除大鼠腎組織纖維化[2-3]，但其具體作用機制尚未得到完全闡明。本實驗擬通過研究HGF及其特異性受體c-Met在5/6腎切除大鼠模型殘腎的表達及六味地黃湯對其表達的影響，探討六味地黃湯抗腎纖維化的可能作用機制，為中醫(yī)藥防治腎間質纖維化提供思路和實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SD大鼠40只，6～8周齡，重量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，批號：SCXK(湘)2009-0004。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持通風、恒溫，每日更換墊料，定期消毒籠具；每天給予12小時燈光照射。

1.1.2主要試劑兔抗大鼠HGF多克隆抗體(BAO911)，購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠c-Met多克隆抗體(BS-0668R)，購自北京博奧森生物技術有限公司；HRP標記山羊抗兔IgG多聚體(PV-9001)、DAB顯色劑試劑盒(AR1022)，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3實驗藥物六味地黃湯(熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g)購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，由課題組自行制備藥液。制備方法：先將藥材用相當于藥材2倍的自來水浸泡2小時，武火煮沸后再文火煎熬30分鐘，過濾后收集煎液，原藥渣再加少量水煎煮，取二煎液。將兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮。濃縮藥液每毫升含生藥1 g。

1.2實驗方法實驗動物按體重從輕到重編號，按隨機數(shù)字表分為假手術組(n=10)、模型組(n=15)和六味地黃湯組(n=15)。動物適用性喂養(yǎng)一周后，模型組、六味地黃湯組均按照文獻[4]在無菌條件下行5/6腎切除手術。用10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，分離左腎，行上下極切除，1周后再次麻醉大鼠，切除右腎。假手術組同期行兩次手術，每次僅打開腹腔，暴露腎臟后關腹。第二次手術后7天，開始進行干預。六味地黃湯組每天上午予六位地黃湯灌胃(大鼠用藥劑量=成人劑量mg/d×0.018/體重)計算[5]。假手術組、模型組均予等體積蒸餾水灌胃。共給藥8周。在造模過程及造模后一周內，模型組3只大鼠、六味地黃湯組2只大鼠死亡。死亡原因有麻醉意外、術中大出血及術后感染等。予以剔除。模型組剩余大鼠12只，六味地黃湯組剩余大鼠13只。

實驗結束后處死大鼠，取出大鼠殘腎組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，分別用于HE、Masson染色及免疫組化檢測。

1.3檢測項目和方法

1.3.1組織學觀察取石蠟塊，4 μm切片后分別進行HE及Masson染色。MOTIC光學顯微鏡下觀察。

1.3.2免疫組織化學檢測采用SP法。取石蠟塊，4 μm切片，常規(guī)脫蠟至水。3% H2O2室溫孵化10分鐘，蒸餾水漂洗后，熱修復抗原，冷卻后用PBS液漂洗兩次。將切片放入濕盒中，每張切片分別滴加兔抗大鼠HGF多克隆抗體50 μl(1∶100稀釋)，37℃孵育2小時。以PBS代替一抗作為空白對照。PBS漂洗滴后滴加HRP標記羊抗兔IgG多聚體50 μl，室溫孵育20分鐘。DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。c-Met染色步驟同HGF。用MOTIC多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)軟件進行分析。每例切片隨機選取10個200倍不重疊視野，計算陽性染色面積與視野內腎間質總面積(去除腎小球)的比值并取平均值。

1.4統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1腎組織光鏡檢查

2.1.1HE染色5/6腎切除大鼠殘腎組織HE染色顯示，假手術組大鼠腎小球、腎小管和間質形態(tài)正常，結構清晰；模型組腎小球系膜細胞增生，部分腎小球形成局灶性或迷漫性硬化，毛細血管絆擴張，腎小囊擴張，腎小囊壁層上皮細胞增生，腎小管發(fā)生代償性擴張，可見蛋白管型，腎間質可見大量炎癥細胞浸潤及纖維組織增生。與模型組相比，六味地黃湯組病理變化較輕，腎小球硬化、腎小管擴張及間質纖維化程度減輕。見圖1。

2.1.2Masson染色5/6腎切除大鼠殘腎組織Masson染色結果顯示，假手術組腎臟形態(tài)正常，腎間質無明顯膠原纖維；模型組腎間質及腎小球內均可見大量染成藍色的膠原纖維；六味地黃丸組膠原纖維也明顯增生，但較模型組減輕。見圖2。

2.2六味地黃湯對5/6腎切除大鼠殘腎組織HGF蛋白和c-Met蛋白的影響

2.2.1HGF蛋白表達免疫組化HGF陽性表達為棕黃色顯色，主要表達于腎小球系膜、基底膜及腎小管上皮細胞的胞漿。假手術組可見有微量陽性表達，模型組、六味地黃湯組呈強陽性表達。計算各組陽性染色面積比，模型組明顯高于假手術組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.013，即P<0.05，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。六味地黃湯組陽性表達強于假手術組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.000，即P<0.01，兩組比較有顯著性差異。六味地黃湯組陽性表達強于模型組，經(jīng)單因素方差分析Dunnett T3法分析，P=0.014，即P<0.05，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。見表1和圖3。

表1　六味地黃湯對5/6腎切除大鼠殘腎組織 HGF/C-met蛋白表達的影響

注：與假手術組相比，aP<0.05；與假手術組相比，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05；與模型組相比，dP<0.01。

2.2.2c-Met蛋白表達免疫組化c-Met陽性表達為棕黃色顯色，主要表達于細胞胞膜。假手術組未見明顯陽性表達，模型組和六味地黃湯組在腎小管上皮細胞胞膜上和腎間質上有陽性表達，部分腎小球系膜細胞胞膜亦有表達。計算各組陽性表達面積，模型組、六味地黃湯組表達明顯強于假手術組，經(jīng)Dunnett T3法分析，P=0.000，即P<0.01，差異有顯著性差異。六味地黃湯組表達強于模型組，經(jīng)Dunnett T3法分析，得出P=0.000，即P<0.01，兩組比較有顯著性差異。見表1和圖4。

3　討論

目前對于腎間質纖維化形成的病理生理機制及其對應的干預手段研究頗多。HGF作為一種對多種器官具有多效性的多肽細胞因子，是目前公認的最重要的抗纖維化因子之一。王昆等[7]研究表明，用HGF干預，可以減輕結締組織生長因子刺激下的人腎小管上皮間質纖維化形成。外源性加入HGF后，對于高糖誘導引起腎間質成纖維細胞，可以通過促進細胞增殖，抑制高糖誘導的細胞肥大，從而減輕腎小管簡直纖維化[8]。HGF抗纖維化作用機制可能包括：拮抗轉化生長因子β1的致纖維化作用；維持細胞外基質的生成和降解平衡；抗炎作用；抑制腎小管上皮細胞間充質轉變；抑制多種腎臟固有細胞的凋亡等[9]。c-Met是HGF的受體，其特點是高親和力低能力，HGF的細胞內效應主要是通過與c-Met結合完成。HGF與c-Met特異結合后，誘導c-Met上的酪氨酸磷酸化。磷酸化后的酪氨酸殘基與含SH2功能區(qū)的信號轉導蛋白結合，聚集細胞內分子，激活細胞內多個信號傳到級聯(lián)從而產(chǎn)生生理效應[10]。HGF/c-Met系統(tǒng)的表達上調是機體的一種防御反應，對抑制腎間質纖維化，維持、重建小管結構和功能起重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除術后大鼠梗殘存腎臟的HGF、c-Met表達明顯升高。提示5/6腎切除術后，殘存腎小球高濾過，殘存腎小管高代謝，引起組織細胞損傷，從而誘發(fā)機體產(chǎn)生一系列防御反應，HGF/c-Met系統(tǒng)上調，促進細胞有絲分裂和損傷修復，從而有助于保護腎臟的結構和功能，抑制腎間質纖維化的產(chǎn)生。

本實驗中，應用六味地黃湯對5/6腎切除術后大鼠干預后，HGF、c-Met表達明顯比模型組升高，腎間質纖維化和腎小球等病理改變比模型組減輕，顯示六味地黃湯能有效促進HGF、c-Met表達，從而延緩腎間質纖維化。

[1]梁明,陳衛(wèi)東.肝細胞生長因子與腎臟纖維化的逆轉[J].臨床合理用藥雜志,2009,2(14):121-123.

[2]何澤云,陳江華,李曉峰.六味地黃丸對5/6腎切除大鼠殘腎腎小球化生的影響[J].湖南中醫(yī)學院報,2004,24(2):1-3.

[3]李萬斌,何澤云.六味地黃丸延緩5/6腎切除大鼠腎組織纖維化研究[J].中國藥師,2009,12(4):411-413.

[4]Tomino Y, Suzuki S, Azushima C, et a1. Asian multicenter trials on urinary type IV collagen in patients with diabetic nephropathy[J]. J Clin Lab Anal, 2001, 15(4):188-192.

[5]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1833.

[6]沙朝暉,付平,周莉,等.大鼠5/6腎切除慢性腎功能衰竭動物模型的實驗研究[J].四川動物,2006,25(3):632-634.

[7]王昆,吳陽,楊昱,等,肝細胞生長因子對結締組織生長因子刺激下腎小管上皮間質纖維化的影響[J].中國實用醫(yī)藥,2011,6(3)：50-51.

[8]牟姍,張慶怡,倪兆慧,等.HGF對高糖誘導腎間質成纖維細胞增殖的影響[J].上海第二醫(yī)科大學學報,2004,24(8):641-644.

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