李建武，李高峰，胡新元，文國(guó)宏*，魏子杰

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅渭源748201；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

馬鈴薯SSR-PCR體系的優(yōu)化與建立

李建武1,2,3，李高峰1,2，胡新元1,2，文國(guó)宏1,2*，魏子杰4

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州730070；2.農(nóng)業(yè)部西北旱作馬鈴薯科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅渭源748201；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

以馬鈴薯葉片DNA為模板，采用單因素試驗(yàn)的方法，對(duì)影響馬鈴薯SSR-PCR反應(yīng)體系的主要成分模板DNA、dNTP濃度、引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度及退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，并建立最優(yōu)化的馬鈴薯SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系。結(jié)果表明：在20μL反應(yīng)體系中，模板DNA用量為60 ng，dNTP為0.3125 mmol∕L，引物濃度為2.4 pmol，Mg2+為1.5 mmol∕L，Taq酶為0.5 U，篩選各引物最適宜的退火溫度，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條帶清晰，優(yōu)化后的SSR反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，可用于馬鈴薯遺傳多樣性分析。

馬鈴薯；SSR-PCR；優(yōu)化

在生產(chǎn)上應(yīng)用的栽培種馬鈴薯均為同源四倍體，以無(wú)性方式繁殖，由于其高度雜合，遺傳背景狹窄，基因分離復(fù)雜，常規(guī)雜交育種效率較低。雜交育種過(guò)程中親本的選擇至關(guān)重要，要求親本攜帶目的基因，同時(shí)親本間存在較大的遺傳差異，依據(jù)親本的農(nóng)藝性狀和系譜關(guān)系確定其遺傳差異易受環(huán)境的影響和經(jīng)驗(yàn)的限制，效率較低[1]。分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，為從DNA分子水平鑒定馬鈴薯不同基因型的遺傳差異提供了有利工具。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記自1991年創(chuàng)立以來(lái)，在馬鈴薯構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)等研究方面也得到了廣泛應(yīng)用[2-5]。本研究對(duì)影響SSR-PCR反應(yīng)體系的各因素進(jìn)行了優(yōu)化，以期建立一套適宜的馬鈴薯SSR反應(yīng)體系，為利用SSR標(biāo)記研究馬鈴薯遺傳多樣性和雜交育種親本選配提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用的6份馬鈴薯基因型為品種‘大西洋’，品系‘M’、‘F’、‘LZ219’、‘LZ205’、‘LZ302’，將各材料種植于大田，在馬鈴薯現(xiàn)蕾期采集幼嫩葉片。其中，在馬鈴薯SSR-PCR優(yōu)化試驗(yàn)中均采用‘大西洋’葉片DNA為模板，在優(yōu)化體系的應(yīng)用試驗(yàn)中采用以上6個(gè)基因型DNA為模板。

1.2 試劑和儀器

PCR反應(yīng)所使用的Taq酶、dNTPs、Buffer（含Mg2+）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，SSR引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。試驗(yàn)儀器為∶Heraeus臺(tái)式高速離心機(jī)，XW-80A漩渦混合儀、Mini-P25離心機(jī)、S1000 PCR儀、FTI-500凝膠成像分析系統(tǒng)。

表1 SSR引物序列及退火溫度Table 1 Pimers and annealing temperature of SSR

1.3 PCR反應(yīng)體系

本試驗(yàn)采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)Taq酶說(shuō)明書建議用量10×Buffer（含Mg2+）2 μL，2.5 mmol∕L dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP各2.5 mmol∕L）2 μL，5.0 U∕μL Taq酶0.25 μL，20 pmol∕μL引物1.00 μL，50 ng∕μL DNA模板1.00 μL建立初始體系，當(dāng)其中某一成分進(jìn)行濃度梯度變化時(shí)，其他成分不變，比較不同處理對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。

1.4 PCR反應(yīng)程序及檢測(cè)

95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min,共35循環(huán)，最后72℃延伸10 min；5℃保存?zhèn)溆?，產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，0.05%EB染色，用DS 2000 Marker（含100，250，500，750，1 000，2000 bp 6條帶）作為分子量梯度的標(biāo)準(zhǔn)，120 V下電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，并照相分析。

1.5 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化采用SSR引物S001，模板采用‘大西洋’葉片基因組DNA。在20 μL反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，各成分的初始濃度需要提前配置，根據(jù)體積變化而形成不同的終濃度，5種PCR主要成分體積變化各設(shè)置8個(gè)濃度梯度，其中10×Buffer（含Mg2+）（3 mmol∕L MgCl2）體積依次為∶0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,3.50,4.00 μL；dNTPs（2.5 mmol∕L）體積依次為∶0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50，4.00μL；引物（20 pmol∕μL）體積依次為∶0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，2.40，2.80，3.20 μL；DNA（50 ng∕μL）體積依次為∶0.40，0.80，1.20，1.60，2.00，2.40，2.80，3.20 μL；Taq酶（5.0 U∕μL）體積依次為∶0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40μL。

1.6 引物退火溫度篩選

退火溫度的篩選采用4對(duì)Tm值不同的引物，退火溫度設(shè)置8個(gè)梯度，根據(jù)PCR儀特點(diǎn)，運(yùn)行前設(shè)定最高和最低退火溫度，中間6個(gè)梯度的退火溫度在PCR擴(kuò)增結(jié)束后確定。PCR反應(yīng)程序以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)均按1.4方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 Buffer(含Mg2+)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響

如圖1所示，泳道1，7，8均沒有擴(kuò)增條帶的產(chǎn)生；而泳道2至6中都有清晰完整的擴(kuò)增片段出現(xiàn)，其中2，3，4，5，6泳道中的條帶亮度均能達(dá)到試驗(yàn)要求，其中4泳道條帶亮度最強(qiáng)，即當(dāng)Buffer（含Mg2+）體積為2.00 μL時(shí)最亮，擴(kuò)增效果較好，也較經(jīng)濟(jì)，為最適反應(yīng)體積。

圖1 Buffer(含Mg2+)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Figure 1 Effects of Buffer(containing Mg2+) concentrations on SSR patterns

2.2 dNTPs對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響

如圖2所示，隨著dNTPs體積的增加，其終濃度增大，PCR擴(kuò)增條帶逐漸變亮，至7泳道即dNTPs體積為3.5 μL時(shí)條帶最亮，第8泳道條帶亮度降低，與目的擴(kuò)增條帶亮度變化趨勢(shì)相同還有產(chǎn)生的二聚體，綜合考慮，選用5泳道即為2.50 μL時(shí)擴(kuò)增效果較好，為最適反應(yīng)體積。

2.3 引物對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響

如圖3所示，隨著引物濃度的增加，目的擴(kuò)增條帶亮帶逐漸增強(qiáng)，至泳道6亮度最強(qiáng)，以后隨著引物終濃度的增大，亮度逐步減弱,其中2至6泳道條帶亮度均可滿足實(shí)驗(yàn)要求。隨著引物終濃度用量的增大，二聚體條帶亮度逐漸增強(qiáng)，但總體而言，二聚體條帶較暗，引物終濃度過(guò)高也會(huì)增加成本，綜合考慮，選擇引物體積用量1.20 μL為宜。

圖2 dNTPs濃度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Figure 2 Effects of dNTPs concentrations on SSR patterns

圖3 引物濃度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Figure 3 Effects of primer concentrations on SSR patterns

2.4 模板DNA濃度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響

圖4 模板DNA濃度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Figure 4 Effects of template DNA concentrations on SSR patterns

如圖4所示，隨著模板DNA終濃度的增大，擴(kuò)增目的條帶亮度逐漸增強(qiáng)，為防止過(guò)高的模板DNA濃度引起非特異性條帶產(chǎn)生，綜合考慮，選擇模板DNA體積用量1.20 μL為宜。

2.5 Taq酶對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響

如圖5所示，隨著Taq酶體積的增加，其終濃度增大，1至5泳道擴(kuò)增條帶亮度逐漸增強(qiáng)，6和7泳道條帶亮度逐漸變暗，8泳道沒有目的條帶出現(xiàn)。2至8泳道均出現(xiàn)了非特異性條帶，這是由于Taq酶濃度過(guò)高發(fā)生較高的錯(cuò)配率而產(chǎn)生非特異性條帶的原因造成的，Taq酶濃度過(guò)低則導(dǎo)致產(chǎn)物合成減少，綜合考慮，確定Taq酶適宜用量為20 μL體系中加入0.10 μL。

圖5 Taq酶濃度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Figure 5 Effects of Taq enzyme concentrations on SSR patterns

2.6 引物退火溫度的篩選

如圖6～9所示，4對(duì)引物各設(shè)置了8個(gè)退火溫度梯度，分別為62.0，61.1，59.3，56.1，52.2，49.2，47.0，46.0℃。在圖6中，引物S002在8個(gè)退火溫度下均有目的條帶產(chǎn)生，隨著退火溫度的降低，條帶亮度逐漸增強(qiáng)后減弱，至52.2℃條帶亮度最強(qiáng)，同時(shí)隨溫度降低非特異性條帶數(shù)量增多、亮度增強(qiáng)，綜合考慮該引物的適宜退火溫度為52.2℃。

在圖7中，引物S003在62.0，61.1℃下沒有目的條帶出現(xiàn)，其它退火溫度下均出現(xiàn)目的條帶，在52.2℃時(shí)目的條帶亮度最強(qiáng)，綜合考慮，該引物的最適退火溫度為56.1℃。

在圖8中，引物S004在8個(gè)退火溫度下均出現(xiàn)目的條帶（在59.3℃時(shí)，條帶亮度較弱），溫度較高條帶亮度較弱，無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)，但當(dāng)溫度較低時(shí)，特異性條帶亮度較弱，同時(shí)非特異性條帶數(shù)量增多、亮度增強(qiáng)，當(dāng)溫度為56.1℃時(shí)，特異性條帶亮度最強(qiáng)，該引物的最適退火溫度為56.1℃。

圖6 引物S002不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 6 Effects of S002 primer annealing temperatures on SSR patterns

圖7 引物S003不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 7 Effects of S003 primer annealing temperatures on SSR patterns

圖8 引物S004不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 8 Effects of S004 primer annealing temperatures on SSR patterns

圖9 引物S005不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 9 Effects of S005 primer annealing temperatures on SSR patterns

圖10 引物S003對(duì)6個(gè)馬鈴薯基因型PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 10 Amplification results by primer S003 for six potato genotypes

在圖9中，引物S005在8個(gè)退火溫度下均出現(xiàn)目的條帶，溫度較高或較低時(shí)條帶亮度較弱，當(dāng)溫度為61.1，59.3，56.1℃時(shí)，特異性條帶亮度最強(qiáng)，綜合各因素，該引物的最適退火溫度為59.3℃。

2.7 優(yōu)化體系的應(yīng)用

利用上述優(yōu)化后的反應(yīng)體系，20 μL反應(yīng)體系含10×Buffer（含Mg2+）2.00 μL，2.5 mmol∕L dNTPs 2.50 μL，5.0 U∕μL Taq酶0.10 μL，20 pmol∕μL引物1.20 μL，50 ng∕μL DNA模板1.20 μL。選擇確定好的退火溫度的引物S003對(duì)6份馬鈴薯基因型進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖10所示，條帶清晰、完整，無(wú)非特異性條帶與二聚體出現(xiàn)，有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。結(jié)果表明，本試驗(yàn)優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，適用于馬鈴薯分子標(biāo)記。

3 討論

PCR反應(yīng)是SSR技術(shù)中的重要環(huán)節(jié)，反應(yīng)體系中各組成成分均影響擴(kuò)增效果。Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響較大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗。引物是關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度，在優(yōu)化過(guò)程中以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。dNTPs濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致聚合酶錯(cuò)誤的滲入，與Taq酶競(jìng)爭(zhēng)Mg2+，使Taq酶活性下降，擴(kuò)增結(jié)果受到影響，同時(shí)提高了成本；dNTPs濃度過(guò)低時(shí)影響合成效率，甚至?xí)驗(yàn)閐NTPs過(guò)早消耗而導(dǎo)致產(chǎn)物單鏈化。Taq酶的使用量過(guò)高，使成本增加，并容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，過(guò)低導(dǎo)致其合成效率的下降。

本試驗(yàn)建立的馬鈴薯SSR-PCR反應(yīng)體系為∶在20 μL反應(yīng)體系中，模板DNA用量為60 ng，dNTPs為0.3125 mmol∕L，引物濃度為2.4 pmol，Mg2+為1.5 mmol∕L，Taq酶為0.5 U。經(jīng)驗(yàn)證，該體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，非特異擴(kuò)增少，擴(kuò)增效果良好，可適用于馬鈴薯的分子標(biāo)記。

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Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Potato

LI Jianwu1,2,3,LI Gaofeng1,2,HU Xinyuan1,2,WEN Guohong1,2＊,WEI Zijie4
(1.Institute of Potato,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.Scientific Observing and Experimental Station of Potato Dry Farming in Northwest China,Ministry of Agriculture,Weiyuan,Guansu 748201,China; 3.Institute of Biotechnology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China; 4.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China)

ract:The main component which affects SSR-PCR reaction system on potato,including template DNA,dNTPs concentration,primer concentration,buffer concentration,Taq enzyme concentration and annealing temperature,were optimized in a single factor experiment,and the optimized SSR amplification reaction system was established.The results indicated that 20μL volume SSR-PCR system containing 60 ng template DNA,0.3125 mmol/L dNTPs,2.4 pmol primer,1.5 mmol/L Mg2+,and 0.5 U Taq polymerase,combined with optimal annealing temperature for each primer,performed well,and the optimized system of SSR-PCR,which was steady and reproducible,could be applied to the study of genetic diversity of potato afterPCRresults were run by 2.0%agarose gel.

rds:potato;SSR-PCR;optimization

S532

B

1672－3635（2013）06-0331-05

2013-10-20

國(guó)家自然基金“四倍體馬鈴薯分子遺傳圖譜的構(gòu)建與淀粉含量等重要農(nóng)藝性狀的QTL定位研究”（31160299）。

李建武（1978-），男，助理研究員，研究方向?yàn)轳R鈴薯遺傳育種。

文國(guó)宏，研究員，主要從事馬鈴薯育種研究，E-mail∶wgh1966@126.com。