姚亮亮，丁俊杰，張鉉哲，顧鑫，楊曉賀，趙海紅，申宏波，劉偉

（1.農(nóng)業(yè)部佳木斯作物有害生物科學觀測實驗站，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，黑龍江佳木斯154007）

黑龍江省鏈格孢屬病原菌的RAPD分析

姚亮亮1，丁俊杰1，張鉉哲2*，顧鑫1，楊曉賀1，趙海紅1，申宏波3，劉偉1

（1.農(nóng)業(yè)部佳木斯作物有害生物科學觀測實驗站，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007；2.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，黑龍江佳木斯154007）

利用RAPD技術(shù)分別對分離自黑龍江省各地區(qū)的90株鏈格孢屬病原菌進行了遺傳多樣性分析。利用NTSYS 2.0進行鏈格孢屬病原菌的聚類分析。RAPD分析結(jié)果表明，引物OPE-19擴增后產(chǎn)生的各個群體間相似性系數(shù)分布在0.60～1.00。在68.0%相似性水平上可劃分為3個主要RAPD組群和8個次要RAPD組群。聚類分析結(jié)果表明，黑龍江省鏈格孢屬病原菌RAPD組群與寄主植物和分離地區(qū)之間沒有相關(guān)性。

鏈格孢屬病原菌；RAPD；馬鈴薯早疫病菌

鏈格孢屬（Alternaria Nees）病原菌屬于半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目黑色菌科，是農(nóng)作物的主要致病菌之一，在全球分布非常廣泛。全世界已描述的近500個鏈格孢屬病原菌的種分類單位中95%以上鏈格孢屬病原菌可兼性寄生于植物，引起農(nóng)作物病害[1]。鏈格孢屬病原菌中存在著豐富的遺傳多樣性。Welsh和Mcclelland[2]采用隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)，用5個RAPD隨機引物擴增了35個A.solani和A.alternata菌株的基因組DNA，通過聚類分析，兩個種之間有明顯的區(qū)別，但每個種內(nèi)的相似性大小與地理來源、寄主和致病性強弱關(guān)系不大。孫霞[3]篩選出的9個隨機引物對57個鏈格孢屬病原菌進行RAPD分析，共得到142個多態(tài)性帶，平均每個引物15.8條帶。聚類結(jié)果顯示，大孢子種和小孢子種能明確區(qū)分成兩組群。RAPD被廣泛應用于鏈格孢屬病原菌遺傳多樣性研究中，但在國內(nèi)還未見同時對A.solani，A.porri及A.brassicola進行遺傳多樣性分析。為了了解黑龍江省A.solani，A.brassicola及A. porri的遺傳結(jié)構(gòu)，從而達到科學監(jiān)測A.solani，A. brassicola及A.porri菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的目的。本研究將利用RAPD分子標記測定3種鏈格孢屬病原菌的遺傳多樣性，為A.solani，A.porri及A.brassicola群體遺傳變異的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈格孢屬病原菌的采集∶2007～2009年在黑龍江省哈爾濱市、齊齊哈爾市、牡丹江市、鶴崗市、佳木斯市和加格達奇市6個地區(qū)采集分別被A.solani侵染的馬鈴薯葉片，被A.porri侵染的大蔥葉片及被A.brassicola侵染的甘藍葉片。切成小片，用70%酒精清洗3～5 s，10%升汞清洗1～2 min，用滅菌過的濾紙吸干。在25℃下放到PDA培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，收集菌絲，轉(zhuǎn)到PDA斜面上于-20℃保藏。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA

采用Goodwin等[4]的方法提取基因組DNA。

1.2.2 DNA濃度與純度的檢測

利用紫外分光光度法將保存的DNA溶液用超純水稀釋一定倍數(shù)，測定其A260和A280，DNA純度依據(jù)A260∕A280判定，比值在1.8以上的DNA符合要求。

1.2.3 RAPD分子標記

選用OPE的1組共20個寡聚核苷酸引物（表1），分別擴增從馬鈴薯上分離的8個鏈格孢屬病原菌，根據(jù)擴增結(jié)果，從中篩選出擴增條帶多、清晰且重復性、差異性好的4個引物。

表1 試驗使用的RAPD引物序列Table 1 Oligonucleotide RAPD primers used in experiment

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對瓊脂糖凝膠電泳圖譜及聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜進行統(tǒng)計。將電泳圖譜上清晰且可重復出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”，同時忽略條帶強弱的差異，生成“0”和“1”組成的原始矩陣。統(tǒng)計各引物的位點。利用NTSYSpc 2.1軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用SAHN程序進行聚類分析，采用UPGMA法（Unweighted pair-group method arithmetic averages，非加權(quán)配對算術(shù)平均法）進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖（Phenogram）。

2 結(jié)果與分析

在20個OPE引物中OPE-4、OPE-11、OPE-19、OPE-20擴增效果較好，其中OPE-19擴增的條帶清晰、條帶數(shù)多，而且特異性條帶數(shù)最多（圖1）。因此，本研究利用OPE-19引物擴增了90個鏈格孢屬病原菌，并分析鏈格孢屬病原菌的遺傳多樣性。

圖1 不同RAPD引物擴增8個鏈格孢菌的基因組DNA的圖譜Figure 1 RAPD profiles of eight Alternaria isolates genomic DNAs amplified by using different RAPD primers

為了分析鏈格孢屬病原菌的遺傳多樣性，本試驗利用OPE-19引物擴增了90株鏈格孢屬病原菌的基因組DNA。根據(jù)OPE-19電泳圖譜中擴增條帶的有無，對DNA擴增條帶進行統(tǒng)計。OPE-19對90個不同鏈格孢屬病原菌的擴增結(jié)果顯示共擴增出18條條帶，其中差異性片段是11條。利用NTSYS分析表明，在被測定的所有鏈格孢屬病原菌中由OPE-19引物擴增后產(chǎn)生的各個群體間相似性系數(shù)分布在0.560～1.000之間。RAPD分析結(jié)果顯示，在68.0%相似性水平上可劃分為3個主要RAPD組群和8個次要RAPD組群（圖2）。

3個主要RAPD組群RG1、RG3和RG5分別是由16個菌株、18個菌株和16個菌株組成的。在11個RAPD組群中，同時含有3種鏈格孢屬病原菌的組群有3個，RG1組群由哈爾濱市分離的蕓苔鏈格孢菌（6個）和蔥鏈格孢菌（1個），以及加格達奇市（1個）、佳木斯市（3個）、牡丹江市（1個）和齊齊哈爾市（4個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG3組群由哈爾濱市分離的蕓薹鏈格孢菌（3個）和蔥鏈格孢菌（3個），以及佳木斯市（1個）、牡丹江市（4個）、齊齊哈爾市（6個）和鶴崗市（1個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG11組群由哈爾濱市分離的蕓苔鏈格孢菌（3個）和蔥鏈格孢菌（3個），以及齊齊哈爾市分離的茄鏈格孢菌（2個）組成；RG5組群由哈爾濱市分離的蕓苔鏈格孢菌（2個），以及哈爾濱市（1個）、牡丹江市（5個）、齊齊哈爾市（7個）和鶴崗市（1個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG6組群由哈爾濱市分離的蔥鏈格孢菌（1個）和牡丹江市分離的茄鏈格孢菌（1個）組成；RG7組群由哈爾濱市分離的蔥鏈格孢菌（2個）和佳木斯市（1個）、牡丹江市（1個）和齊齊哈爾市（1個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG8組群由哈爾濱市分離的蔥鏈格孢菌（2個）和佳木斯市（1個）、牡丹江市（2個）和齊齊哈爾市（4個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG2組群由佳木斯市（2個）、牡丹江市（1個）和齊齊哈爾市（2個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG8組群由哈爾濱市（1個）、牡丹江市（2個）和齊齊哈爾市（6個）分離的茄鏈格孢菌組成；RG4只包含一個佳木斯分離的茄鏈格孢菌；RG10只包含一個哈爾濱市分離的蔥鏈格孢菌。以上結(jié)果說明RAPD組群與寄主植物和分離地區(qū)之間沒有相關(guān)性。

圖2 黑龍江省各地區(qū)和不同寄主植物上分離的90個不同的鏈格孢屬病原菌基于RAPD（引物OPE-19）DNA指紋的的聚類分析Figure 2 Dendrograms of 90 Alternaria pathogen isolates collected from different locations and host plants based on RAPD（primer OPE-19）DNA fingerprints in Heilongjiang

3 討論

本研究利用RAPD技術(shù)分析了采自黑龍江省6個地區(qū)的不同寄主上分離的90個鏈格孢屬病原菌的遺傳多樣性，比較了RAPD圖譜遺傳多態(tài)性與寄主植物和孢子類型之間的相關(guān)性。Mahuku等[5]的研究結(jié)果顯示，RAPD標記對基因組學提供有用信息。因為RAPD無論在啟動位點內(nèi)或啟動位點之間能檢測到基于堿基序列的變化，包括插入、缺失、置換和倒置。RAPD分析結(jié)果表明，3種鏈格孢種A.solani，A.brassicola及A.porri的種間親緣關(guān)系很近，但是在種內(nèi)存在著明顯的變異。A.solani分布在10個RAPD組群上；A.brassicola分布在4個RAPD組群上；A.porri分布在7個RAPD組群上。以上結(jié)果表明鏈格孢菌屬真菌具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析圖中可以看出，A.solani，A.brassicola及A.porri同時分布在一個RAPD組群上，因此僅靠RAPD標記并不能區(qū)分3種鏈格孢屬病原菌。這些結(jié)果與王洪凱等[6]以及Roberts等[7]的研究結(jié)果一致。

RAPD分析結(jié)果顯示，在68.0%相似性水平上可劃分為3個主要組群和8個次要組群（圖2）。結(jié)果還顯示，牡丹江市和齊齊哈爾市分離的馬鈴薯早疫病菌分別劃分為8個RAPD組群。Goodwin[8]報道，遺傳多樣性最多的地區(qū)是病菌起源中心。根據(jù)這一結(jié)論，我們初步推測黑龍江省馬鈴薯早疫病可能是由牡丹江和齊齊哈爾地區(qū)為起源中心開始擴散。

[1]方中達.植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[2]Welsh J,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research,1990,18(24): 7213-7218.

[3]孫霞.鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學,2006.

[4]Goodwin S B,Drenth A,Fry W E.Cloning and genetic analyses of two highly polymorphic,moderately repetitive nuclear DNAs from Phytophthora infestans[J].Current Genetics,1992,22:107-115.

[5]Mahuku G,Peters R D,Platt H W,et al.Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis of Phytophthora infestans isolates collected in Canada during 1994 to 1996[J].Plant Pathology,2000,49(2):252-260.

[6]王洪凱,張?zhí)煊?張猛.鏈格孢屬真菌分類研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報,2001,32(3):406-410.

[7]Roberts R G,Reymond S T,Anderson B.RAPD fragment pattern analysis and morphological segregation of small-spored Alternaria species and species group[J].Mycological Research,2000,104 (2):151-160.

[8]Goodwin S B.The population genetics of Phytophthora[J]. Phytopathology,1997,87:462-473.

RAPD Analysis of Alternaria Pathogens in Heilongjiang Province

YAO Liangliang1，DING Junjie1，ZHANG Xuanzhe2＊，GU Xin1，YANG Xiaohe1，ZHAO Haihong1，SHEN Hongbo3，LIU Wei1
(1.Observation and Experiment Station of Crop Pests of Jiamusi,Ministry of Agriculture/Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Jiamusi,Heilongjiang 154007,China;2.College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin, Heilongjiang 150030,China;3.Heilongjiang Agricultural College of Vocational Technology,Jiamusi,Heilongjiang 154007,China)

To understand the genetic diversity of 90 Alternaria pathogen isolates collected from Heilongjiang Province, the genotypic characteristics was performed by using random amplified polymorphic DNA(RAPD),and cluster analysis of Alternaria pathogens was carried out by using NTSYs program.RAPD results indicated that the similarity coefficients of RAPD group amplified by the primer OPE-19 ranged from 0.60 to 1.00.According to RAPD analysis by using the primer OPE-19,90isolateswereseparatedintothreemajorRAPDgroupsandeightminorgroupsatthesimilaritylevelof68.0%.The cluster analysis results suggested that RAPD groups not be correlated with the host plants and locations where the isolates werecollected.

Alternaria pathogens；RAPD；Alternaria solani

S532

B

1672－3635（2013）06-0365-05

2013-11-28

國家農(nóng)業(yè)部948項目“馬鈴薯地上壟體栽培模式配套與示范”（2011-Z52）。

姚亮亮（1985-），男，碩士，實習研究員，主要從事作物病害及綜合防治技術(shù)研究。

張鉉哲，教授，主要從事作物病害及綜合防治技術(shù)研究，E-mail∶zhe3850@yahoo.com.cn。