劉慧敏，鄭文斌，孔令梅，張海都，陳若偉，洪璧楷

（1.汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭，515041；2.汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院放射科，廣東 汕頭515041）

急性酒精中毒臨床常見。酒精及其氧化產物，如乙醛、乙酸鹽具有很強的神經毒性作用，酒精中毒可以誘導腦組織出現細胞毒性水腫，早期星形膠質細胞細胞毒性水腫顯著［1－2］。急性酒精中毒所致腦水腫類型及水腫程度在活體水平很難做到定量診斷，而DTI作為MRI的一項新技術，在診斷腦水腫方面具有獨特的優(yōu)勢。水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）是大腦組織重要的水通道蛋白，在維持大腦組織水平衡中起重要作用，其在各種病理損害所致的腦水腫形成過程中的作用機制越來越受到關注。腦干中央的髓鞘溶解即瓦勒變性是酒精中毒腦白質嚴重損害之一［3－4］。本研究利用DTI參數值觀察大鼠腦干部在急性酒精中毒后的演變規(guī)律，探討AQP4在腦水腫形成過程的作用機制及其與DTI的相關性，為臨床診斷及治療提供定量影像指標。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，體質量200～250 g，由汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物自由進食及飲水。動物房內12 h光暗交替。相對濕度55%，溫度22℃。

1.1.2 主要儀器與試劑 使用 GE Signa HDx 1.5 T超導MR儀，3 in線圈，病理攝像彩色頭（日本奧林巴斯公司）及AQP4（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 實驗方案 大鼠隨機分為正常對照組（n＝5）和急性酒精中毒組（n＝25），急性酒精灌酒后1、3、6、12、24 h行 MRI。隨后斷頭取腦，選取腦干部分別行HE染色及AQP4免疫組化染色，比較對照組與實驗組的DTI及病理結果。

1.2.2 實驗模型 以往實驗［5］研究表明，當以15 ml／kg體質量灌胃時可達到急性酒精中毒標準。本實驗用酒為北京紅星二鍋頭食用白酒（56%v／v），主要成分是乙醇、水，產地北京，按15 ml／kg體質量的劑量一次性灌胃。對照組大鼠以15 ml／kg體質量食用自來水灌胃。

1.2.3 MRI檢查 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 ml／kg體質量）麻醉，麻醉滿意后，行 MRI掃描，充分保暖，放置MRI掃描床，俯臥位，頭先進。掃描序列包括 T2WI、T1WI及DTI，掃描參數：T1WI：TR 263.3 ms，TE 23.4 ms，層厚3.0 mm，無間隔，翻轉角90°；T2WI采用FSE：TR 4 420 ms，TE 108.3 ms，層厚3.0 mm，無間隔，翻轉角90°；DTI單次激發(fā)自旋平面回波序列（SE－EPI）：TR 6 000 ms，TE 107.7 ms，層厚3.0 mm，無間隔，FOV 12 c m×12 cm，矩陣128×128，NEX 1，b值＝1 000 s／mm2，采集方向為25個。

1.2.4 DTI數據處理 MRI掃描完成后將原始數據送至 A W4.3工作站（GE mdeiacl syste m advantage window 4.3），使用Functool軟件重建ADC圖及部分各向異性（fractional anisotropy，FA）圖，將大小為5 mm2的ROI置于原始圖像腦干部進行測量。為減少測量時放置ROI受主觀因素影響，請2位經驗豐富的醫(yī)師測量，取平均值。

1.2.5 病理學檢查 取材后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，組織塊經脫水透明石蠟包埋成塊，組織切片烤干后分別行HE、AQP4免疫組織化學染色。免疫組化染色圖像分析應用Image－Pro Pl us 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)測定免疫反應產物的累積光密度值（IOD值），每張切片取5個視野，所得數據經計算取每組均值。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，數值以±s表示。急性酒精中毒各組均數分別與對照組進行獨立樣本均數t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MRI檢查結果 對照組及實驗組大鼠在常規(guī)T2WI及T1WI均未見明顯異常信號。DTI掃描（圖1，2，見封3），ADC值及FA值測量結果（見表1）：實驗組1、3、6 h ADC值與對照組比較組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），12、24 h組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組各時間點FA值與對照組比較組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。酒精中毒組ADC值與FA值24 h內變化趨勢一致，先持續(xù)降低后逐步回升（圖3，見封3）。

2.2 病理組織學檢查結果 HE染色（圖4，見封3）：對照組腦干部細胞形態(tài)正常，細胞間隙未見增寬及變窄，細胞染色均勻，中毒組星形膠質細胞數目減少、核固縮，突起減少或消失，神經纖維束疏松；AQP4免疫組化染色（圖5，見封3），對照組平均光密度值為0.228±0.022，造模后急性酒精中毒組AQP4表達光密度值先持續(xù)降低后逐步回升（圖3，見封3），3 h達最低點，1、3、6、12、24 h平均光密度值分別為0.218±0.038，0.201±0.035，0.209±0.027，0.225±0.032，0.229±0.028；與對照組比較，3、6 h的AQP4表達光密度值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），1、12、24 h差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 酒精中毒各組ADC、FA值（±s）

表1 酒精中毒各組ADC、FA值（±s）

注：FA：部分各項異性；＊P＜0.01

參數值 對照組 急性酒精中毒組1 h 3 h 6 h 12 h 24 h ADC值（×10－3 mm2／s）FA值0.880±0.014 0.341±0.062 0.845±0.052＊0.339±0.023 0.800±0.056＊0.314±0.021 0.837±0.033＊0.319±0.054 0.873±0.062 0.331±0.031 0.879±0.057 0.335±0.023

3 討論

腦水腫主要分2種類型，細胞毒性水腫和血管源性水腫。細胞毒性水腫指在血腦屏障完整的條件下，水分子主要積聚在細胞內，常繼發(fā)于各種缺血、缺氧性腦損害；血管源性水腫指血腦屏障受損，毛細血管通透性增加，液體主要積聚在細胞外周，多見于腦挫裂傷、腦腫瘤壓迫和炎癥性疾?。?］。急性酒精中毒引起的腦水腫類型主要是細胞毒性水腫［1－2］；酒精在代謝過程中產生大量的氧自由基，易直接對腦組織產生氧化損傷［7］；酒精干擾谷氨酸鹽受體、阿片類物質、GABA（γ－氨基丁酸）受體及5－羥色胺等多種物質在細胞內外的分布，造成細胞內外滲透梯度改變［8－11］。酒精代謝產物乙醛及乙酸鹽具有較高的神經毒性作用，血液中高濃度乙醛可以直接滲透血腦屏障，干擾遞質傳遞，直接附著于蛋白、酶、核酸及其他一些生物因子并干擾它們的功能。乙酸鹽堆積抑制葡萄糖代謝，造成ATP生成減少，Na＋／K＋泵功能受限，Na＋在細胞內堆積，引起細胞腫脹，另外葡萄糖代謝受抑制，局部血流量減少，誘發(fā)腦組織缺血缺氧性損害［12－13］。細胞內外離子分布失衡、缺血缺氧性損害以及滲透梯度變化均可誘發(fā)細胞毒性水腫。

DTI作為MRI的新技術，不僅對評價錐體束病變及檢測彌漫性軸索損傷（DAI）具有一定敏感性［14－15］，而且可以檢測水分子彌散的FA、彌散速率及彌散方向的改變，定量分析ADC值及FA值的變化。ADC值變化不僅反映細胞內外水自穩(wěn)狀態(tài)，而且可以反映細胞外間隙及細胞體積變化，水分子在細胞內彌散運動受到細胞膜及細胞器的限制。當細胞外水分移至細胞內時，水分子彌散速率較正常組織減小，ADC值較正常組織減低。水分子彌散速率較正常組織增加，ADC值增高是出現血管源性水腫的標志［2，16］。FA值代表彌散各向異性，其值正常范圍是0～1，0代表彌散方向最大同向性，1代表彌散方向最大異向性。研究［17］證實，組織內液體徑向彌散速率降低時，FA值出現降低趨勢。李雪萊等［2］研究重癥急性酒精中毒大鼠1 h內腦組織變化情況發(fā)現，重度酒精中毒組大鼠腦組織在DWI上出現異常高信號，ADC值降低。本實驗中，酒精中毒后24 h內研究結果表明，ADC值和FA值變化趨勢表現為先下降后逐步回升，灌酒3 h內大鼠腦干部ADC值出現持續(xù)下降，原因在于急性酒精中毒早期以細胞毒性腦水腫為主，酒精及其代謝產物滲透細胞膜，引起細胞內代謝發(fā)生紊亂，酶和膜系統(tǒng)發(fā)生功能障礙，鈉鉀泵失調及大量鈣離子內流，使細胞外水進入細胞內，細胞內水分子彌散受到細胞膜及細胞器的限制，所以ADC值降低，這與李雪萊等［2］研究結果基本一致。本實驗結果表明3 h后ADC值是逐步回升的，提示細胞毒性水腫程度的減輕。FA值出現的變化趨勢與ADC值一致，是先降低后回升，但各時間點FA值與對照組比較，組間差異均無統(tǒng)計學意義，我們認為，急性酒精中毒對腦干組織微結構和環(huán)境改變有一定的影響，但對反映水分子擴散各向異性程度的FA值變化不明顯，間接反映了急性酒精中毒腦干部組織完整性破壞并不嚴重，提示水腫狀態(tài)恢復正常是組織結構完整的基礎。

AQP4作為中樞神經系統(tǒng)最主要的水通道蛋白，主要在血－腦和腦脊液－腦交界面上的星形膠質細胞上表達，對維持腦內水平衡起著非常重要的作用。由于研究側重點、方法及部位的不同，AQP4在腦水腫形成及發(fā)展過程中的變化仍存在爭議。Amir y－Moghadda m等［18］研究發(fā)現，膠質細胞足突部AQP4能夠調節(jié)水分子的雙向運輸，當細胞內水分子積聚增多時，AQP4表達下調以減少水分子內流，細胞間隙內水分子積聚增多即血管間隙內水分子積聚增多時，AQP4表達上調轉運細胞外水分子至細胞內。研究證實［19－21］，在腦組織缺血缺氧早期AQP4表達是降低的，這反映了機體內在的防御機制，即AQP4在早期的表達降低減少了細胞外水分子的跨膜轉運，抑制了膠質細胞細胞毒性水腫的加重。Ke等［22］對大鼠重癥腦外傷模型AQP4在腦水腫發(fā)展過程中表達多樣性的研究發(fā)現，腦外傷血腦屏障遭到破壞時，即血管源性水腫時，AQP4表達下調以防止在滲透梯度及靜水壓的作用下水分子由血液進入腦組織，阻止腦水腫進一步惡化，在細胞毒性水腫存在時預測AQP4通道能夠和K＋ 通道協(xié)同作用減輕細胞腫脹程度。湯崇輝［23］在急性酒精中毒對大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦水腫研究中發(fā)現，急性酒精中毒能夠加重腦水腫程度，AQP4的表達有利于腦水腫消退。實驗組大鼠腦干部AQP4表達趨勢表現為先下降后逐步回升，3 h下調到達最低點，到24 h AQP4表達上調超過正常對照組。細胞外水分進入細胞內時，腦組織出現細胞毒性水腫，由于機體的自我保護機制，AQP4下調以減少依賴AQP4通道的水分子從細胞外向胞內轉移，以抑制細胞毒性水腫的加重，3 h后AQP4表達上調，由于AQP4雙側雙向轉運機制和AQP4表達的實效性及階段性特點，AQP4不僅是水進入腦組織的通路，也是水排出腦組織的主要通路，可易化腦內多余水分的清除［24］。

研究表明［25］，正常腦組織中AQP4表達可以調節(jié)ADC值，在中風及外傷等急性神經性疾病中，影像學改變部分歸因于組織AQP4表達水平的改變。本實驗中，酒精中毒后3 h內細胞水腫程度逐漸加重，ADC值逐步降低，在同時間段里，AQP4表達下調，這反映了機體為阻止水分子進一步向細胞內轉運、減輕細胞內水腫而出現相應的保護性機制。酒精中毒3 h后AQP4表達及ADC值不再繼續(xù)下降，而同期出現逐漸回升，這反映了細胞內水腫程度的逐步減輕、細胞內微環(huán)境逐漸改善。DTI檢查反映了急性酒精中毒早期所出現的細胞毒性水腫，ADC值變化可以為臨床對急性酒精中毒的治療提供參考價值。

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