1引言

熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在衛(wèi)生檢驗(yàn)、環(huán)境分析、食品分析、藥物分析、生化與臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用^[1～7]。高通量、快速熒光檢測系統(tǒng)因能將批量分析速度提高數(shù)倍至數(shù)十倍^[8～12]，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。商品化的單通道微孔板熒光儀^[13～15]為實(shí)現(xiàn)高通量熒光檢測提供了技術(shù)支持，具有檢測速度快、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。多通道熒光激發(fā)與檢測相對于單通道熒光激發(fā)與檢測具有更高的通量，可成倍提高檢測速度^[16，17]。微孔板的多通道熒光激發(fā)一般通過光分束鏡實(shí)現(xiàn)激發(fā)光源的均分耦合多通道激發(fā)光纖傳輸^[16]；多通道發(fā)射光的采集通過耦合多通道發(fā)射光纖傳輸^[16，17]，檢測或通過多個(gè)檢測單元同時(shí)檢測^[16]，或通過一個(gè)檢測單元順序檢測^[17]得以實(shí)現(xiàn)。一般需要較為復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)。

本研究對基于商品化一字線激光模組的多通道激發(fā)/熒光成像進(jìn)行了研究，設(shè)計(jì)了一套結(jié)構(gòu)簡單、小巧輕便、成本低廉，具有多通道特點(diǎn)的高通量便攜式熒光檢測裝置，結(jié)合自行研制的圖像處理軟件，實(shí)現(xiàn)了溶液的高通量定量檢測。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1裝置的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

裝置的基本工作原理如圖1所示：一字線激光模組發(fā)出線狀激發(fā)光，將盛有待測溶液的排狀微孔板置于線狀輻射光路時(shí)，溶液受激發(fā)而發(fā)光，CCD數(shù)碼相機(jī)采集經(jīng)濾光片濾去背景光的熒光圖像，圖像經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行研制的圖像處理軟件處理轉(zhuǎn)化為熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。裝置的主要部件包括激發(fā)光源、CCD數(shù)碼相機(jī)、圖像處理軟件、排狀微孔樣品板。

2.1.1激發(fā)光源激發(fā)光源采用商品化一字線激光模組。一字線激光模組是通過在激光點(diǎn)光源前安裝一個(gè)鮑威爾棱鏡（Powell lens），使激光束通過非球面透鏡轉(zhuǎn)化為光密度較為均勻、穩(wěn)定性好、直線性好的一條直線。激光模組的波長分布從紫外到紅外波段，通過更換激光光源，可實(shí)現(xiàn)對不同激發(fā)波長物質(zhì)的檢測。

2.1.2CCD數(shù)碼相機(jī)

2.1.3圖像處理軟件圖像處理軟件ChemImageProcessor（CIP）為實(shí)驗(yàn)室自行研制，用于處理和分析熒光圖像。CIP可以加載、顯示熒光圖像，并可以掃描圖像上的每個(gè)熒光光斑，計(jì)算出每個(gè)光斑的總亮度，即熒光強(qiáng)度。

2.1.4排狀微孔樣品板排狀微孔樣品板為12孔/條×8條的白色96孔可拆微孔板（上海精睿公司），一次可進(jìn)行12通道的同時(shí)檢測。以手動(dòng)更換微孔條更換檢測溶液。也可配以電子機(jī)械移動(dòng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

2.2化學(xué)試劑羅丹明B（RB）、氯金酸（HAuCl·4H2O）、檸檬酸三鈉與硼砂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鄰巰基苯甲酸（TSA，98%）與2，6吡啶二羧酸（PDCA，99%），購自百靈威公司；Hg單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ（18 MΩ·cm）超純水。鄰巰基苯甲酸修飾納米金（TSA@Au）的合成方法參考文獻(xiàn)[18]。

2.3裝置性能測試

以RB作為測試溶液，對裝置的穩(wěn)定性、精密度和靈敏度等主要性能參數(shù)進(jìn)行評價(jià)。RB的激發(fā)和發(fā)射波長分別為λex=552 nm， λem=572 nm。激發(fā)光源選用M532UL5一字線激光模組（20 mW，532 nm，西安銘輝公司），發(fā)射光濾光片選用560 nm長波通濾光片（深圳激埃特公司）。

2.4水溶液中Hg2+濃度檢測

在排狀微孔樣品板上依次加入一定濃度的TSA@Au和RB，不同濃度的Hg2+，用5 mmol/L pH 8.0硼砂緩沖液稀釋至300 μL，超聲混合均勻后，用本研究構(gòu)建的高通量便攜式熒光檢測裝置對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。

2.5自來水和湖水樣品中Hg2+濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)室自來水龍頭打開5 min后，采集自來水樣。湖水樣采自于廈門大學(xué)芙蓉湖表層湖水。水樣分別經(jīng)由0.22 μm的過濾膜過濾后， 存儲(chǔ)于4 ℃的冰箱中待用。分別平行取3份145 μL自來水樣或湖水樣，在其中分別加入5 μL Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，Hg2+加標(biāo)濃度分別為60、120和240 μg/L，按2.4節(jié)（稀釋2倍）方法檢測熒光強(qiáng)度。

3結(jié)果與討論

3.1裝置的特點(diǎn)

目前，商品化和文獻(xiàn)報(bào)道的微孔板熒光儀的光路系統(tǒng)較為復(fù)雜，并且需要專業(yè)的精密調(diào)節(jié)^[13～17]。本高通量便攜式熒光檢測裝置具有如下特點(diǎn)：（1）易于搭建整套裝置的光路系統(tǒng)簡單，可方便快捷地搭建；（2）便攜整套裝置選用小型化器件組裝，小巧輕便。整套裝置的尺寸為225 mm×225 mm×230 mm， 重量約1 kg，便于攜帶，適用于現(xiàn)場快速檢測；（3）成本低廉整套裝置的成本約3000元；（4）多通道一字線激光模組是線狀光源，輻照寬度與光源距樣品的距離有關(guān)。樣品距光源越遠(yuǎn)，激光線越長，輻照寬度越寬，但相應(yīng)的單孔光源強(qiáng)度減弱。同時(shí)檢測的樣品數(shù)可通過調(diào)節(jié)光源與樣品的距離確定。相對于現(xiàn)有的微孔板熒光儀每增加一個(gè)檢測通道，都要相應(yīng)增加光學(xué)元件和檢測器相比，更為簡單靈活；（5）檢測速度快對96孔微孔板樣品的檢測與數(shù)據(jù)處理可在10 min內(nèi)完成。

3.2裝置性能評價(jià)

3.2.1光源強(qiáng)度分布及光源校正在排狀樣品微孔條上的12個(gè)微孔池中分別加入300 μL 3×10

Symbolm@@ 8 mol/L RB溶液， 以一字線激光模組線狀激光光源激發(fā)，以此考察各微孔池接收到的一字線激光模組線狀激光強(qiáng)度的差異性。[TS（][HT5”SS]圖212孔樣品微孔3.3裝置的應(yīng)用性能評價(jià)

3.3.1水溶液中Hg2+檢測為了評價(jià)裝置的可應(yīng)用性，本研究發(fā)展了基于Hg2+誘導(dǎo)TSA@AuRB能量轉(zhuǎn)移熒光強(qiáng)度檢測的新方法。在pH 8.0的硼砂溶液介質(zhì)中，TSA@Au金膠因表面帶負(fù)電荷而與呈陽離子狀態(tài)的RB通過靜電作用形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移復(fù)合物^[18]。以RB的最大激發(fā)波長激發(fā)RB時(shí)，因TSA@Au的作用，RB作為能量給體熒光被猝滅。當(dāng)體系中存在微量Hg2+時(shí)，Hg2+可誘導(dǎo)帶負(fù)電的TSA@Au發(fā)生螯合作用團(tuán)聚而釋放出RB，從而調(diào)節(jié)TSA@AuRB復(fù)合物的能量轉(zhuǎn)移效率，觀察到體系的熒光強(qiáng)度對Hg2+濃度呈正相關(guān)響應(yīng)。在溶液中加入PDCA配體可增強(qiáng)體系對Hg2+的選擇性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 本裝置具有結(jié)構(gòu)簡單、小巧輕便、成本低廉，多通道與檢測速度快的特點(diǎn)。由于所選用的一字線激光模組輻照到各樣品微孔池上的光源強(qiáng)度存在差異，因此以RB水溶液作為光量子計(jì)對光源強(qiáng)度進(jìn)行歸一化校正。本裝置有望用于大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測?，F(xiàn)有的裝置是通過手動(dòng)更換微孔條更換檢測溶液，若采用電子機(jī)械設(shè)備實(shí)現(xiàn)樣品微孔板的移動(dòng)，可進(jìn)一步提高檢測速度。

References

1Guirgis B S S， Cunha C S E， Gomes I， Cavadas M， Silva I， Doria G， Blatch G L， Baptista P V， Pereira E， Azzazy H M E， Mota M M， Prudencio M， Franco R. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（3）： 1019-1027

2Chen X Q， Tian X Z， Shin I， Yoon J. Chem. Soc. Rev.， 2011， 40（9）： 4783-4804

3Gao F， Ye Q Q， Cui P， Zhang L. J. Agric. Food. Chem.， 2012， 60（18）： 4550-4558

4YANG JianLei， ZHU Tuo，XU Yan， FAN WenLai，CHEN GuoQing，WU Hao. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2009， 29（12）： 3339-3343

楊建磊， 朱 拓， 徐 巖， 范文來， 陳國慶， 武 浩. 光譜學(xué)與光譜分析， 2009， 29（12）： 3339-3343

5He J L， Wu Z S， Zhou H， Wang H Q， Jiang J H， Shen G L， Yu R Q. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1358-1364

6Li H L， Zhang Y W， Wang L， Tian J Q， Sun X P. Chem. Commun.， 2011， 47（3）： 961-963

7Chang H X， Tang L H， Wang Y， Jiang J H， Li J H. Anal. Chem.， 2010， 82（6）： 2341-2346

8Azab H A， ElKorashy S A， Anwar Z M， Khairy G M， Steiner M S， Duerkop A. Analyst， 2011， 136（21）： 4492-4499

9Yang W C， Swartz J R. Anal. Biochem.， 2011， 415（2）： 168-174

10Hieb A R， D'Arcy S， Kramer M A， White A E， Luger K. Nucleic Acids Res.， 2012， 40（5）： e33

11Harbinson J， Prinzenberg A E， Kruijer W， Aarts M G M. Curr. Opin. Biotechnol.， 2012， 23（2）： 221-226

12LIU Nan， SU Pu， ZHU MaoXiang， YANG ZhiHua， PAN XiuJie， WANG HongYong， CHAO FuHuan， GAO ZhiXian. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（5）： 673-677

劉 楠， 蘇 璞， 朱茂祥， 楊陟華， 潘秀頡， 王紅勇， 晁福寰， 高志賢. 分析化學(xué)， 2010， 38（5）： 673-677

13BioTek Synergy H4 Hybrid MultiMode Microplate Reader， website： http：//www.biotek.com/products/microplate_detection/synergyh4_hybrid_multimode_microplate_reader.html

14Thermo Scientific Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer， website：

http：//www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail？productId=11962281groupType=PRODUCTsearchType=0storeId=11152from=search

15Promega GloMaxMulti+ Microplate Multimode Reader with InstinctTM， website： http：//www.promega.com/products/pm/fluorometersluminometersmultimodereaders/glomaxmultiplusinstinct/

16YU ChangQing， ZHAO HaiYing， FANG WeiJun， DOU XiaoMing. Chinese Invention Patent， 2002， 02136100.2

于常青， 趙海鷹， 方為軍， 竇曉鳴. 國家發(fā)明專利， 2002， 02136100.2

17FENG JiHong， ZENG Yi， GENG LiNa， ZHANG QingYue， LIU ChangBo， ZHANG Lan. Chinese Invention Patent， 2007， 200710177465.4

馮繼宏， 曾 毅， 耿利娜， 張清悅， 劉長波， 張 蘭. 國家發(fā)明專利， 2007， 200710177465.4

18Huang C C， Chang H T. Anal. Chem.， 2006， 78（24）： 8332-8338