[HT][HK40][HT5”H]摘要[HTSS]用瑞利散射光譜法研究了魚血清蛋白在不同濃度有機(jī)弱酸水溶液中的變性情況，并結(jié)合液相色譜法討論了魚肉樣品中主要基體蛋白質(zhì)與魚油對(duì)喹諾酮類藥物（QNs）殘留提取的影響。研究表明， 0.5 mol/L檸檬酸水溶液可引起蛋白質(zhì)緩慢且完全變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與QNs絡(luò)合物離解，釋放結(jié)合的藥物。本研究以檸檬酸水溶液為生物親和提取液，發(fā)展了一種高效樣品前處理方法，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定了魚肉中QNs殘留。樣品前處理過程為：稱取適量勻漿后的魚肉樣品于聚四氟乙烯管中，以0.5 mol/L檸檬酸水溶液提取QNs殘留2次，分別取2 mL提取液加入PSA和Cleanert NH2 混合顆粒吸附劑進(jìn)行凈化。本方法用于測(cè)定魚肉樣品中的依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星和加替沙星，回收率為82.0%～95.2%，RSD為1.9%～5.8%，檢出限為0.0055～0.016 mg/kg。方法步驟簡單、快速、可靠、環(huán)境友好。

1引言

喹諾酮類藥物（Quinolones，QNs） 是一類人工合成的抗菌藥，其中最為常見的是依諾沙星（Enoxacin，ENX），諾氟沙星（Norfloxacin，NOR），環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），洛美沙星（Lomefloxacin，LOM），恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）和加替沙星（Gatifloxacin，GAT）等。QNs具有低廉的價(jià)格和良好的廣譜抗菌性，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。然而，QNs在水產(chǎn)品中的過量殘留會(huì)引起食用者腸道菌群失衡，甚至癌變，從而威脅人類健康^[1]。世界食品法典委員會(huì)和世界各國對(duì)水產(chǎn)品中QNs殘留均有嚴(yán)格的限量要求，國際貿(mào)易中也對(duì)其限量有嚴(yán)格規(guī)定。因此，QNs的殘留檢測(cè)尤為重要。

水產(chǎn)品中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等復(fù)雜基體，因此，水產(chǎn)品中QNs殘留檢測(cè)的關(guān)鍵是樣品前處理。目前，有關(guān)動(dòng)物組織樣品中QNs殘留檢測(cè)的樣品前處理方法報(bào)道較多^[2～7]，所涉及的方法主要為藥物殘留提取、固相萃?。⊿PE）凈化兩個(gè)步驟，提取液一般為可以沉淀蛋白質(zhì)的乙腈與酸（包括三氯乙酸、鹽酸、甲酸等）混合溶液。這些方法的缺點(diǎn)是耗用大量的有機(jī)溶劑， 樣品前處理步驟多， 提取液凈化復(fù)雜，極易造成殘留藥物的損失。Stubbings

等以乙腈為提取液，以固相分散萃?。―SPE）技術(shù)簡化了樣品凈化步驟，但仍然需要使用乙腈作為溶劑^[8]。

本課題組在研究水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法中，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)基體與藥物的結(jié)合作用影響水產(chǎn)品中藥物殘留的提取效率^[9～11]。已有研究表明，QNs與蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合作用^{[12，13]}，這會(huì)降低QNs殘留的萃取效率。傳統(tǒng)提取方法中乙腈與酸的混合液作為提取液時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生快速沉淀，引起藥物包裹損失。弱酸水溶液也可以使蛋白質(zhì)發(fā)生變性、沉淀，但作為QNs殘留提取劑尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選擇合適濃度的檸檬酸水溶液作為QNs殘留提取劑，使蛋白質(zhì)完全變性，離解與其結(jié)合的藥物，以期提高QNs殘留提取效率，建立了一種簡單、快速、高效和環(huán)保無污染的水產(chǎn)品樣品前處理方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國Varian公司）；1100液相色譜儀（美國安捷倫公司）； JJ2（200361）組織搗碎勻漿機(jī)（常州國華電器有限公司）。

ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT標(biāo)準(zhǔn)品（純度 92.0%～97.0%，中國藥品生物制品檢定所）；魚血清白蛋白（FSA，煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供），制備方法見文獻(xiàn)[14]；PSA（N丙基乙二胺修飾的硅膠）粉末、Cleanert NH2 SPE（氨基修飾的硅膠）粉末（天津博納艾杰爾公司）；草酸、檸檬酸、三氯乙酸（優(yōu)級(jí)純）和乙腈、甲酸（色譜純）均為天津科密歐試劑公司產(chǎn)品。鯉魚樣品購于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：ENX， NOR，CIP，LOM，ENR和GAT用1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L HCl溶液配制成1000 mg/L的單標(biāo)和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

2.2色譜條件

液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫25℃；流動(dòng)相為乙腈2%甲酸（15∶85， V/V）；流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.3樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g勻漿后的樣品（鯉魚脊背肉）于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10.0 mL 0.5 mol/L檸檬酸溶液，振蕩，渦旋1 min，靜置30 min。待沉淀完全后取上清液于20 mL聚四氟乙烯管中，殘?jiān)?.0 mL 0.5 mol/L檸檬酸水溶液再次提取，兩次提取液合并后取2 mL上清液， 加入20 mg PSA，渦旋，離心（6000 r/min）5 min，取上清液過0.45 μm濾膜后，供HPLC分析。

分 析 化 學(xué)第41卷

第10期李桂芝等： 檸檬酸水溶液生物親和萃取高效液相色譜法檢測(cè)魚肉樣品中喹諾酮類藥物殘留

3結(jié)果與討論

3.1蛋白質(zhì)對(duì)提取QNs回收率的影響

QNs與BSA（牛血清白蛋白）、FSA具有較強(qiáng)結(jié)合作用，結(jié)合常數(shù)大于104 mol/L^[12～14]。為討論提取QNs時(shí)，蛋白質(zhì)、魚油對(duì)回收率的影響，做如下實(shí)驗(yàn)： 取6個(gè)20 mL聚四氟乙烯離心管，編號(hào)1～6，分別向1和2管中加入0.5 mL水、向3和4管中加入0.5 mL 1.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L FSA溶液， 向5和6管中加入10 mg魚油；6個(gè)離心管中均加入10 μL 1000 mg/L QNs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置30 min。以GB/T 203662006^[15]方法，用甲酸乙腈溶液作為提取液測(cè)定回收率。不同基質(zhì)時(shí)，QNs提取回收率測(cè)定結(jié)果為：空白樣品81.7%～87.9%； 蛋白質(zhì)69.31%～73.3%；魚油80.2%～87.2%。提取方法相同時(shí)，以FSA為基體的QNs提取回收率明顯低于以水和魚油為基體的回收率，說明QNs與FSA（模擬樣品基體）的結(jié)合降低了QNs的提取效率，魚油對(duì)QNs的提取率影響較小。因此在測(cè)定以蛋白質(zhì)為主要基體的水產(chǎn)品中QNs殘留時(shí)，應(yīng)考慮蛋白質(zhì)對(duì)萃取效率的影響。 [TS（][HT5”SS]圖1不同弱酸濃度對(duì)魚血清蛋白瑞利散射強(qiáng)度的影響

Fig.1Fish serum albumin （FSA） synchronous Rayleigh scattering intensity in different concentration of weak acid

a. 檸檬酸（Citric acid）； b. 草酸（Oxalic acid）； λex=λem=483 nm. CFSA=1.00×10

Symbolm@@ 6 mol/L。[HT5][TS）]

3.2蛋白質(zhì)變性對(duì)QNs提取回收率的影響

3.2.1瑞利散射光譜研究不同濃度弱酸對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時(shí)，瑞利散射光譜可以反映出蛋白質(zhì)的變性程度和分子結(jié)構(gòu)變化，故采用共振瑞利散射研究不同濃度弱酸由圖 1 可見，當(dāng)檸檬酸和草酸這兩種弱酸的濃度達(dá)到一定值時(shí)，蛋白質(zhì)開始變性，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)外露，溶解性變小，形成小于散射波長尺度的小顆粒而產(chǎn)生瑞利散射^[16]；當(dāng)弱酸濃度合適時(shí)，形成散射的小顆粒濃度最大，瑞利散射強(qiáng)度也最大。當(dāng)弱酸濃度進(jìn)一步增加時(shí)，蛋白質(zhì)變性速度加快，蛋白質(zhì)之間疏水基團(tuán)相互聚集形成尺度大于散射波長的大顆粒，引起瑞利散射強(qiáng)度迅速下降；當(dāng)弱酸濃度過大時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)生快速聚集，并最終形成沉淀，不再產(chǎn)生瑞利散射。當(dāng)弱酸濃度適當(dāng)時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生緩慢變性，與其結(jié)合的藥物可以發(fā)生離解作用；如果弱酸的濃度太高則容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集沉淀，對(duì)藥物產(chǎn)生包裹作用。因此，在測(cè)定蛋白質(zhì)為基體的樣品中QNs殘留時(shí)，可以選擇合適的弱酸濃度實(shí)現(xiàn)藥物的高效提取。

[TS（][HT5”SS]圖2不同濃度檸檬酸水溶液對(duì)喹諾酮藥物提取回收率的影響

Fig.2Effect of different concentration of citric acid on the recoveries of quinolones

1. 依諾沙星； 2. 諾氟沙星； 3. 環(huán)丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩諾沙星； 6. 加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.2.2不同濃度弱酸對(duì)實(shí)際樣品中喹諾酮藥物提取回收率的影響為了進(jìn)一步闡明不同濃度弱酸對(duì)實(shí)際樣品中QNs提取回收率的影響，采用HPLC分析不同濃度草酸和檸檬酸提取液提取QNs時(shí)藥物的回收率。分別準(zhǔn)確稱取2.0 g魚肉樣品于20 mL聚四氟乙烯管中，加入10 μL 1000 mg/L QNs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置30 min，用不同濃度弱酸提取液提取QNs，

計(jì)算回收率。結(jié)果表明，不同濃度的草酸提取液對(duì)魚肉樣品中QNs的提取回收率均低于50%；不同濃度檸檬酸水溶液對(duì)魚肉樣品中QNs的提取效率影響見圖2。當(dāng)檸檬酸濃度在0.1～2.0 mol/L時(shí)，提取液對(duì)QNs的提取回收率較高。這是因?yàn)榇藭r(shí)檸檬酸水溶液使蛋白質(zhì)發(fā)生緩慢變性， 釋放了與其結(jié)合的藥物。而當(dāng)檸檬酸水溶液濃度大于2 mol/L時(shí)，蛋白質(zhì)快速變性、凝聚而包裹了藥物，因此回收率偏低。選擇0.5 mol/L檸檬酸作為實(shí)際樣品測(cè)定提取液。

3.3提取液凈化步驟的改進(jìn)

由3.1和3.2節(jié)可知，蛋白質(zhì)對(duì)QNs殘留的提取影響較大， 0.5 mol/L檸檬酸溶液可有效提取樣品中的QNs。由于提取液為弱酸水溶液，極性較強(qiáng)，因此提取液中的脂溶性雜質(zhì)較少，可以簡化凈化步驟。實(shí)驗(yàn)表明，PSA和Cleanert NH2的混合顆粒吸附劑可有效去除雜質(zhì)，而對(duì)QNs吸附作用可以忽略。[TS（][HT5”SS]圖3樣品加標(biāo)（0.5 mg/kg）的高效液相色譜圖

Fig.3Chromatograms of six quinolones obtained by spiked fish sample. Sample spiked at 0.5 mg/kg

1. 依諾沙星； 2. 諾氟沙星； 3. 環(huán)丙沙星； 4. 洛美沙星； 5. 恩諾沙星； 6.加替沙星。

1. Enoxacin； 2. Norfloxacin； 3. Ciprofloxacin； 4. Lomefloxacin； 5. Enrofloxacin； 6. Gatifloxacin.[HT5][TS）]

3.4樣品加標(biāo)測(cè)定結(jié)果及方法的準(zhǔn)確度、檢出限與回收率

準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用1.0 mmol/L HCl稀釋成 0.025， 0.10， 0.40和1.6 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供HPLC分析，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，以平均峰面積（y）與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x， mg/L）做線性回歸分析，結(jié)果見表1。

對(duì)魚肉空白樣品進(jìn)行3個(gè)水平（0.25， 0.5和1.0 mg/kg）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品前處理如2.3節(jié)所述，平行測(cè)定5次，樣品加標(biāo)色譜圖見圖3，計(jì)算結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在本研究所選實(shí)驗(yàn)條件下，6種QNs 能被很好地萃取與分離， 回收率為82.0%～95.2%， RSD為1.9%～5.8%，根據(jù)DL=3S/N計(jì)算得出本方法的檢出限為0.0055～0.016 mg/kg。本方法的回收率與精密度均好于國標(biāo)方法，且樣品前處理步驟少，便于操作。

2.1

3.5實(shí)際樣品分析

用活鯉魚進(jìn)行了環(huán)丙沙星喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，喂養(yǎng)量為每天20 mg/kg，連續(xù)喂養(yǎng)4 d，宰殺后取魚肉進(jìn)行環(huán)丙沙星殘留檢測(cè)，得到了陽性檢驗(yàn)結(jié)果。

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