本文系教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 （No. 20093227110010 ）， 江蘇大學(xué)科研基金 （No. 08JDG001）， 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

1引言

天然產(chǎn)物的抗氧化成分是指從天然動(dòng)植物或其代謝產(chǎn)物中提取出來的能夠清除氧自由基或活性氧，抑制或減緩氧化反應(yīng)的一類物質(zhì)，包括黃酮類、酚酸類、生物堿類、多糖類、苷類等^[1]，其清除體內(nèi)自由基而降低氧化性損傷的作用一直是廣泛研究的熱門課題^[2，3]。在天然抗氧化劑清除氧自由基作用的機(jī)理研究中，其與抗氧化酶是否具有協(xié)同抗氧化是研究熱點(diǎn)。

在生物體的代謝過程中產(chǎn)生的各種活性氧主要包括H2O2， ，·OH， NO·和烷氧自由基等^[4]，其中·OH的氧化活性最強(qiáng)，其標(biāo)準(zhǔn)電極電勢(shì)達(dá)到2.80 V，僅次于F2，是一種極強(qiáng)的氧化劑^[5]。它能非特異性地氧化一些生物大分子，如脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)，導(dǎo)致氧化性損傷，從而引起很多疾病，如關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化、糖尿病、老年性癡呆、癌癥、衰老等^[6]。因此，·OH一直受到人們的普遍關(guān)注。過氧化氫酶（CAT；EC1.11.1.6）是一種廣泛存在于生物組織中的氧化還原酶。其在體內(nèi)可通過催化氧代謝中間產(chǎn)物H2O2生成H2O和O2，阻止H2O2對(duì)組織的侵害，同時(shí)該酶對(duì)·OH具有清除作用^[7]。在測(cè)定酶或天然抗氧化劑對(duì)·OH的清除作用時(shí)，首先需要建立一個(gè)·OH產(chǎn)生體系和對(duì)·OH的測(cè)定方法?！H非常活潑，壽命短，產(chǎn)生量少^[8]，在研究天然抗氧化劑對(duì)其清除作用時(shí)所建立的測(cè)定方法有考馬斯亮藍(lán)G250褪色光度法^[9]、高效液相色譜法^[4，10]、電子自旋共振法^[11]、毛細(xì)管電泳法^[8，12]。

以抗壞血酸/Fe2+作為·OH產(chǎn)生體系，以苯甲酸為·OH捕捉劑，通過對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物間羥基苯甲酸進(jìn)行定量計(jì)算^[13]，可以測(cè)定體系中生成的·OH。當(dāng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，間羥基苯甲酸生成量將會(huì)減少，依此可確定清除劑對(duì)·OH的清除率。由于苯甲酸和間羥基苯甲酸的吸收光譜有重疊，需要采用分離檢測(cè)的方法，毛細(xì)管電泳無疑是一個(gè)適用的手段。本研究對(duì)此·OH的毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行了研究，并利用建立的方法研究了CAT與原花青素及CAT與綠原酸的協(xié)同清除·OH的作用。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀，配32Karat數(shù)據(jù)采集工作站和PDA檢測(cè)器（美國Beckman Coulter公司）； 未涂層石英毛細(xì)管柱（60 cm×75 μm i.d.， 有效長(zhǎng)度50 cm，邯鄲銳灃色譜器件有限公司）； FL2000高效液相色譜儀（福立儀器有限公司）； 色譜柱（250 mm× 4.6 mm），填料為Hypersil BDS C18（大連依利特分析儀器有限公司）； BS 124S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； pHS3BW型酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器分析廠）； H6型恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）； 優(yōu)譜超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

CAT（酶活力≥2000 U/mg）、原花青素（HPLC≥98%）、綠原酸（UV≥95%）， 均購自上海源葉生物科技有限公司； Gibco新生牛血清（Invitrogen公司）； 硼酸、硼砂、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、FeSO4·7H2O、苯甲酸、間羥基苯甲酸、L抗壞血酸、無水乙醇、三苯基膦等試劑均為分析純（上海國藥化學(xué)試劑有限公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，電阻率18.2 MΩ·cm。

2.2電泳條件

運(yùn)行緩沖液含30 mmol/L SDS、10 mmol/L硼砂，pH 9.2。分離電壓20 kV，壓力（3.5 kPa）進(jìn)樣5 s，分離柱溫25 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

毛細(xì)管在第一次使用前需沖洗，所用沖洗劑和沖洗時(shí)間分別為甲醇5 min，水3 min，1.0 mol/L HCl 5 min，水3 min，1.0 mol/L NaOH 10 min，水3 min，0.1 mol/L NaOH 10 min，水3 min，緩沖液5 min，樣品間用0.1 mol/L NaOH、水、緩沖液分別沖洗3 min。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

于1.5 mL潔凈的離心管中依次加入20 μL CAT滅活血清、50 μL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、·OH清除劑（分別為不同濃度CAT、原花青素、綠原酸）、0.5 mL 10 mmol/L Fe2+EDTA、0.1 mL 10 mmol/L 苯甲酸（用乙醇水（1∶1， V/V）配制），最后加入10 μL 0.1 mol/L 的抗壞血酸啟動(dòng)這個(gè)反應(yīng)，然后迅速向體系中加水至1 mL，搖勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)2 h后進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)定。以間羥基苯甲酸峰面積為定量依據(jù)，分別測(cè)定未加·OH清除劑時(shí)的間羥基苯甲酸峰面積A0和加入·OH清除劑的峰面積A，則·OH清除劑對(duì)其清除率可用I=（A0-A）/A0×100%進(jìn)行計(jì)算。

3結(jié)果與討論

3.1電泳條件的優(yōu)化

緩沖液的pH值可通過影響管壁硅羥基和組分的電離程度而影響各分析物的分離效果。研究了緩沖液的pH值在7.4～10.0范圍內(nèi)對(duì)分離的影響。當(dāng)pH<8.4時(shí)，EDTA和反應(yīng)產(chǎn)物間羥基苯甲酸之間不能達(dá)到基線分離； 當(dāng)8.410.0時(shí)，過高的pH值對(duì)管壁的影響可造成電滲流不穩(wěn)定，且分析物遷移時(shí)間過長(zhǎng)。綜合分離效果和遷移時(shí)間，選擇pH=9.2。

SDS濃度通過改變各分析物的保留因子而影響分離度。在20～60 mmol/L范圍內(nèi)考察了SDS濃度對(duì)分離度的影響。隨著SDS濃度的增大，各物質(zhì)在膠束中的保留增強(qiáng)，遷移時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，分離度也逐漸增大。當(dāng)SDS濃度為30 mmol/L時(shí)，峰高最大； 且隨著SDS濃度的繼續(xù)增大，焦耳熱迅速增加，導(dǎo)致峰形有所擴(kuò)散。綜合考慮， SDS濃度選擇30 mmol/L。

電解質(zhì)濃度直接影響電滲流和分析物的擴(kuò)散，進(jìn)而影響各反應(yīng)物的分離?？疾炝穗娊赓|(zhì)濃度為10～30 mmol/L時(shí)體系的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，在此范圍內(nèi)，各分析物都能很好分離，隨著硼酸鹽濃度增大，各分析物的遷移時(shí)間延長(zhǎng)。為盡可能加快分析速度，硼酸鹽濃度選擇10 mmol/L。

在14～26 kV范圍內(nèi)研究了分離電壓對(duì)分離的影響，在此范圍內(nèi)各分析物均可實(shí)現(xiàn)基線分離，且提高分離電壓可以有效縮短物質(zhì)的遷移時(shí)間； 但當(dāng)電壓超過20 kV時(shí)，基線的噪聲增加。綜合各因素，分離電壓選擇20 kV。

在上述優(yōu)化條件下，測(cè)定間羥基苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，得到其回歸方程為y=2.23×108x+5647.60 （R2=0.9989， n=5），其中y是峰面積，x是間羥基苯甲酸的濃度（mol/L）；線性范圍是5.00×10

3.2·OH產(chǎn)生體系的確定及產(chǎn)生條件的優(yōu)化

目前，多利用Fenton反應(yīng)體系研究天然抗氧化劑對(duì)·OH的清除作用。該體系直接由H2O2產(chǎn)生·OH。由于CAT能夠催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，在測(cè)定CAT與天然抗氧化劑協(xié)同清除·OH的作用時(shí)，CAT可通過轉(zhuǎn)化H2O2干擾·OH的穩(wěn)定產(chǎn)生，并由此影響CAT對(duì)·OH 進(jìn)行直接清除時(shí)的清除率測(cè)定?？箟难?Fe2+體系產(chǎn)生·OH的過程是：抗壞血酸在有氧條件下自氧化生成

，再與H+反應(yīng)生成H2O2，H2O2在Fe2+作用下生成·OH^[14]。盡管在后期生成·OH利用的仍然是Fenton反應(yīng)原理，但這里產(chǎn)生的H2O2屬于中間產(chǎn)物，產(chǎn)量比Fenton體系中人為加入的量要少得多。CAT屬于觸酶，催化H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧氣是通過2個(gè)H2O2分子同時(shí)在其活性位點(diǎn)相遇而實(shí)現(xiàn)。已有研究表明，底物濃度越高，CAT的催化作用越強(qiáng)^[15]。故在Fenton體系中CAT的存在會(huì)影響·OH的產(chǎn)生，但在本體系中影響較小。通過向該反應(yīng)體系中加入H2O2捕捉劑三苯基膦，利用高效液相色譜法^[16]對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間所得產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)，

[TS（][HT5”SS]圖1反應(yīng)時(shí)間對(duì)H2O2產(chǎn)生的影響

Fig.1Effect of reaction time on the production of H2O2[HT5][TS）]

結(jié)果如圖1所示。在2 h后由于體系中抗壞血酸反應(yīng)完全，H2O2的產(chǎn)生亦達(dá)到飽和，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該體系中在2 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)累積生成H2O2的量確實(shí)遠(yuǎn)少于Fenton體系中的使用量，而且反應(yīng)過程中H2O2是陸續(xù)產(chǎn)生的，每一時(shí)刻的產(chǎn)生量要遠(yuǎn)小于檢測(cè)到的量，這些對(duì)于CAT催化H2O2是極為不利的。可以認(rèn)為在CAT未及催化H2O2前，H2O2已被轉(zhuǎn)化為·OH。故在該體系中可忽略CAT催化H2O2的作用，可選擇該體系作為本研究中的·OH產(chǎn)生體系。

在該·OH產(chǎn)生體系中，考慮到實(shí)際樣品基質(zhì)的影響，本研究以CAT滅活的血清樣品基質(zhì)作為應(yīng)用之例。為使·OH產(chǎn)生量最大，在未加入·OH清除劑的反應(yīng)體系中，應(yīng)首先對(duì)各反應(yīng)物的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。為此，在含20 μL CAT滅活血清基質(zhì)的磷酸鹽緩沖液中，先加入Fe2+EDTA，再加入自由基捕捉劑苯甲酸，最后加入少量抗壞血酸啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)。在該·OH產(chǎn)生體系中，為了盡可能地抑制抗壞血酸的抗氧化作用，應(yīng)盡量降低其濃度，并使加入Fe2+的量大于抗壞血酸。研究了Fe2+與抗壞血酸的摩爾比對(duì)間羥基苯甲酸峰面積（表示目標(biāo)產(chǎn)物的生成量）的影響（圖2a）。當(dāng)比值大于5時(shí)，產(chǎn)物的量已不再增加，故將比值定為5。

自由基捕捉劑苯甲酸的濃度對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物間羥基苯甲酸的生成量影響也很大。在0.2～1.4 mmol/L范圍內(nèi)考察了苯甲酸濃度對(duì)間羥基苯甲酸峰面積的影響（圖2b）。當(dāng)苯甲酸的濃度增至1.0 mmol/L時(shí)，產(chǎn)物的量達(dá)到最大，濃度繼續(xù)增加，產(chǎn)物的量略有下降，可能是隨著苯甲酸濃度的增大，體系中溶劑乙醇的量增加，而羥自由基可與乙醇反應(yīng)，致使產(chǎn)物的量略有下降^[17]。

反應(yīng)時(shí)間同樣影響著目標(biāo)產(chǎn)物的生成量。如圖2c所示，目標(biāo)產(chǎn)物生成量隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，至2 h達(dá)到飽和，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)物量增加不明顯，其原因同樣是體系中抗壞血酸反應(yīng)完全，·OH來源物質(zhì)H2O2的產(chǎn)生達(dá)到飽和。其變化趨勢(shì)上也與圖1相同。故反應(yīng)時(shí)間選擇為2 h。

[TS（][HT5”SS]圖2Fe2+和抗壞血酸摩爾比 （a）、苯甲酸濃度 （b） 和反應(yīng)時(shí)間 （c） 對(duì)產(chǎn)物峰面積的影響

Fig.2Effect of molar ratio of Fe2+ and ascorbic acid （a）， benzoic acid concentration （b） and reaction time （c） on peak area of product[HT5][TS）]

為準(zhǔn)確測(cè)定·OH清除劑對(duì)其的清除率，應(yīng)保證清除劑在反應(yīng)體系中能與·OH充分反應(yīng)，捕獲劑苯甲酸的加入不應(yīng)對(duì)此反應(yīng)產(chǎn)生干擾。理論上，當(dāng)實(shí)際樣品中的·OH清除劑與其反應(yīng)速度遠(yuǎn)大于·OH 與苯甲酸的反應(yīng)速度時(shí)，即可以認(rèn)為苯甲酸的加入對(duì)產(chǎn)物生成量沒有影響。分別在加入CAT/原花青素/綠原酸0～100 min（時(shí)間點(diǎn)間隔10 min）后加入苯甲酸，測(cè)定加入時(shí)間對(duì)產(chǎn)物生成量的影響，證明加入時(shí)間對(duì)產(chǎn)物生成量無影響，即在反應(yīng)體系中·OH清除劑與其反應(yīng)速度遠(yuǎn)大于·OH與苯甲酸的反應(yīng)速度，·OH清除劑可以與苯甲酸同時(shí)加入。

3.3產(chǎn)物的穩(wěn)定性及唯一性

在反應(yīng)體系中，苯甲酸捕獲·OH后所形成產(chǎn)物間羥基苯甲酸是否穩(wěn)定，將決定以峰面積作為定量指標(biāo)是否準(zhǔn)確。為此，在選定的·OH產(chǎn)生體系中加入間羥基苯甲酸，在反應(yīng)2 h后測(cè)定其峰面積，并與同樣濃度的間羥基苯甲酸直接分離測(cè)定的峰面積進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在測(cè)定誤差范圍內(nèi)，間羥基苯甲酸的峰面積未發(fā)生改變，說明該產(chǎn)物是穩(wěn)定的，用其峰面積作為定量指標(biāo)是可靠的。

在反應(yīng)體系中，當(dāng)苯甲酸捕獲·OH后，除產(chǎn)物間羥基苯甲酸外，是否還同時(shí)生成了其它產(chǎn)物，將決定著產(chǎn)物是否唯一的問題。如果產(chǎn)物不唯一，以捕獲劑苯甲酸峰面積的減小量作為定量指標(biāo)將會(huì)簡(jiǎn)化反應(yīng)機(jī)理的影響。為此，在反應(yīng)體系中加入苯甲酸，反應(yīng)2 h后測(cè)定其峰面積，并與同樣濃度的苯甲酸直接分離測(cè)定的峰面積進(jìn)行比較；同時(shí)測(cè)定產(chǎn)物間羥基苯甲酸的峰面積。結(jié)果表明，在測(cè)量誤差范圍內(nèi)，苯甲酸的減少量與間羥基苯甲酸的生成量相同，可以認(rèn)為在誤差范圍內(nèi)產(chǎn)物是唯一的。這表明苯甲酸的減少量和間羥基苯甲酸的生成量都可以作為定量指標(biāo)，而直接測(cè)定產(chǎn)物峰面積更為簡(jiǎn)便，故選擇以間羥基苯甲酸峰面積作為定量指標(biāo)。

3.4方法的重現(xiàn)性和回收率

將反應(yīng)液平行進(jìn)樣5次，產(chǎn)物的峰面積和遷移時(shí)間的RSD分別為3.2%和2.7%，產(chǎn)物的平均生成濃度為1.99×10

Symbolm@@ 4 mol/L。根據(jù)產(chǎn)物是苯甲酸的一取代產(chǎn)物可知，與苯甲酸結(jié)合的羥自由基的濃度為1.99×10

Symbolm@@ 4 mol/L。圖3為由1 mmol/L抗壞血酸、1 mmol/L苯甲酸和0.05 mmol/L間羥基苯甲酸組成的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和反應(yīng)液的電泳圖。

[TS（][HT5”SS]圖3標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和反應(yīng)溶液（b）的電泳圖

Fig.3Electropherogram of the standard （a） and reaction solution （b）

1. 抗壞血酸 （Ascorbic acid）； 2. 苯甲酸 （Benzoic acid）； 3. 間羥基苯甲酸 （mHydrobenzoic acid）； 4. Fe2+EDTA.[HT5][TS）]

向反應(yīng)后的反應(yīng)體系中加入5 μL 1 mmol/L 間羥基苯甲酸標(biāo)品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定。目標(biāo)產(chǎn)物5次測(cè)定的平均加標(biāo)回收率為103.7%，說明方法準(zhǔn)確可靠。

從樣品電泳圖中可見到十分顯著的產(chǎn)物峰，這個(gè)事實(shí)說明在本研究采用的·OH產(chǎn)生體系中，CAT催化中間產(chǎn)物H2O2生成H2O和O2的速率不及H2O2轉(zhuǎn)化為·OH的速率。否則，將不能產(chǎn)生足夠的·OH來生成圖中的產(chǎn)物，而本研究通過實(shí)驗(yàn)也證明了苯甲酸不能與H2O2直接反應(yīng)生成這個(gè)產(chǎn)物。此結(jié)論與文獻(xiàn)[18，19]相吻合，充分說明本體系可以用于測(cè)定CAT對(duì)·OH的直接清除作用。

3.5CAT、原花青素和綠原酸對(duì)·OH的清除活性

分別將CAT、原花青素和綠原酸各自的濃度系列加入反應(yīng)液測(cè)定其對(duì)·OH的清除率（每個(gè)濃度平行做5次，取平均值），以清除率Y（%）對(duì)濃度X （mg/L） 分別進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表1；應(yīng)用此方程可以得出在含20 μL CAT滅活血清的背景基質(zhì)下，各物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的半數(shù)清除率IC50（表1）。原花青素和綠原酸為多酚類化合物，其清除·OH可能的機(jī)制是酚羥基與·OH反應(yīng) [20]或與環(huán)上C直接相連

的氫原子參與了抗氧化過程^[21]。

3.6CAT與原花青素和與綠原酸的協(xié)同抗氧化作用及量效關(guān)系

協(xié)同抗氧化作用是指在CAT和天然抗氧化劑同時(shí)存在時(shí)， 對(duì)固定量活性氧產(chǎn)生的清除率大于

[Fig.4Synergistic effect of PACs and CAT， CGA and CAT scavenging ·OH[HT5][TS）]

由圖4可知，在固定CAT加入量的情況下，隨著原花青素濃度的增加，各IP1與相應(yīng)IP2的差值逐漸增大，將原花青素濃度與IP1和IP2各差值進(jìn)行F檢驗(yàn)，有p<0.05，即原花青素提升CAT ·OH清除率的劑量依賴性顯著，說明原花青素與CAT清除·OH的協(xié)同作用具有量效關(guān)系。而在固定CAT加入量的情況下，隨著綠原酸濃度的增加，各IC1與相應(yīng)IC2差值雖略有變化，但將綠原酸濃度與IC1和IC2的各差值進(jìn)行F檢驗(yàn)，有p>0.05，即綠原酸對(duì)提升CAT ·OH清除率的劑量依賴性不顯著，說明綠原酸與CAT清除·OH的協(xié)同作用不存在量效關(guān)系。

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