1引言

有機磷農(nóng)藥（Organophosphate pesticide， OP）是目前使用量最大的農(nóng)藥種類之一，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病蟲害的防治。不合理地使用OP，使其在植物體內(nèi)大量殘留。該類農(nóng)藥屬于強的神經(jīng)毒劑，能不可逆地抑制人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的活性^[1]，使其催化水解乙酰膽堿的能力受到抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿在體內(nèi)積累，從而使人體神經(jīng)系統(tǒng)中一些生理功能受到影響，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡^[2，3]。因此，建立一種響應(yīng)快速、靈敏度高、準確可靠的檢測OP的新方法具有重要意義。

目前，氣相色譜法^[4-6]、高效液相色譜法^[7-9]、氣相色譜質(zhì)譜法^[10]等已廣泛用于檢測OP，而且能夠得到準確的結(jié)果，但這些方法大多儀器貴重、操作復(fù)雜、耗費時間長，不便于現(xiàn)場檢測。近年來，電化學(xué)傳感檢測方法因其操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、儀器便宜等優(yōu)點更是備受關(guān)注。目前OP的電化學(xué)傳感檢測方法^[11-14]一般利用其對AChE的不可逆抑制作用，通過檢測AChE催化水解氯化乙酰硫代膽堿（Acetylthiocholine， ATCl）產(chǎn)生硫代膽堿氧化電流的大小，實現(xiàn)痕量有機磷農(nóng)藥的檢測。有機磷農(nóng)藥對AChE的抑制率與硫代膽堿的氧化電流的減小量成正比，但是其氧化電位較高，其它干擾物質(zhì)在這一電位下也會氧化，產(chǎn)生氧化電流，造成干擾。

本研究構(gòu)建一種新型AChE電化學(xué)傳感器，用于OP的檢測。首先，金電極表面的AChE在沒有納米金種子的情況下催化底物ATCl產(chǎn)生硫代膽堿，硫代膽堿還原氯金酸，生成納米金種子；將電極置于銀增強液中，納米金催化銀在較低的電位下沉積形成銀包金的核殼結(jié)構(gòu)，而聚集的銀又進一步催化更多Ag+還原，用溶出伏安法定量檢測沉積銀的量，實現(xiàn)了信號的再次放大。該傳感器基于生物催化納米金粒子的生成和納米金粒子電催化銀沉積，實現(xiàn)了信號的雙重放大，而在沒有納米金顆粒的區(qū)域，銀不會被催化還原^[15-17]，使得背景電流很小，與其它電化學(xué)AChE傳感器相比，具有更低的背景干擾和檢出限^[18，19]。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

CHI 900B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統(tǒng)：殼聚糖修飾的組裝了乙酰膽堿酯酶的金電極（AChECHIT/Au）為工作電極，飽和Hg2Cl2電極（SCE）為參比電極，鉑電極為輔助電極。用CHI 660C工作站，于5 mmol/L Fe（CN）64

氯化乙酰硫代膽堿、乙酰膽堿酯酶（Type C3389，500 U/mg）和戊二醛（25%），購自美國SigmaAldrich公司；馬拉硫磷（標準品）、殼聚糖Chitosan（CHIT，脫乙酰度為85%）、氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、AgNO3、磷酸鹽緩沖液（PBS， pH=7.4）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀等。其它試劑均為分析純，水溶液均用超純水配制。1.0 mol/L NH32.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L AgNO3的混合溶液作為銀增強劑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2.2AChEChitosan 修飾電極的制備

用2.0 mol/L 乙酸溶液溶解殼聚糖，配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%（w/V） 的殼聚糖溶液，用NaOH溶液調(diào)至pH=5.0，放于冰箱中備用。

金電極在修飾前，先分別用0.3和0.05 μm的氧化鋁粉拋光至形成鏡面，再將電極于超純水、乙醇和超純水中各超聲5 min洗凈，用N2吹干。在打磨處理好的金電極表面滴加3 μL 0.5%（w/V） 殼聚糖溶液，在室溫下過夜晾干，然后用超純水清洗，N2吹干。將5 μL 20 U/mL的乙酰膽堿酯酶溶液和1 μL戊二醛（2.5%）混合液滴于電極表面，置于濕氣盒中反應(yīng)1 h，構(gòu)建成乙酰膽堿酯酶和殼聚糖修飾的金電極（AChECHIT/Au）。

2.3對乙酰膽堿酯酶抑制劑的檢測

實驗原理如圖1所示，將AChECHIT/Au電極浸在含有不同濃度馬拉硫磷的磷酸鹽溶液（PBS）中，室溫下反應(yīng)15 min，然后用PBS溶液沖洗干凈，N2吹干。再在AChECHIT/Au修飾電極上滴加20 μL 納米金生成液（0.05%（V/V）HAuCl43 mmol/L ATCl），室溫下反應(yīng)15 min，用超純水清洗，N2吹干。再將電極置于1.0 mol/L NH3（1）AChECHIT/Au電極；（2）滴加納米金生成液的AChECHIT/Au電極；（3）電沉積銀的AuNPs/AChECHIT/Au電極。

（1） AChECHIT/Au； （2） AChECHIT/Au with the treatment of AuNPs growth solution； （3） AuNPs/AChECHIT/Au with the electrochemical deposition of silver.[HT5][TS）]

3.2不同修飾電極銀的溶出檢測

將AChECHIT/Au修飾電極在酶催化生成納米金和進一步電沉積銀后在0.1 mol/L HNO3溶液掃LSV，通過比較銀的溶出電流來分析有機磷對乙酰膽堿酯酶的抑制性（圖3）。在AChECHIT/Au電極上滴加20 μL 0.05% HAuCl4，在

Symbolm@@ 0.10 V電位下電沉積銀后于0.1 mol/L HNO3溶液中線性掃描，未得到銀的溶出響應(yīng)峰（曲線1）。向組裝好的酶電極滴加20 μL納米金生成液（含3 mmol/L ATCl ），電沉積銀后在0.27 V出現(xiàn)顯著的溶出響應(yīng)峰，

10 V電位下，銀在生成的納米金粒子表面沉積，因此滴加了含3 mmol/L ATCl的納米金生成液的AChECHIT/Au電極得到明顯的銀溶出響應(yīng)峰，而滴加了0.05% HAuCl4的酶電極沒有明顯的銀溶出峰。馬拉硫磷作為一種有機磷農(nóng)藥，能不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，使電極表面酶催化底物水解生成的硫代膽堿的量減少，進而還原生成的納米金粒子也減少，在納米金粒子表面沉積的銀也就隨之減少，在0.27 V得到的銀的溶出響應(yīng)峰明顯減小，約45 μA（曲線3）。由此可見，通過檢測銀的溶出響應(yīng)峰可實現(xiàn)馬拉硫磷有機磷農(nóng)藥的高靈敏檢測。

3.4ATCl的濃度和納米金生成時間的影響

納米金粒徑的數(shù)目和大小直接影響銀沉積的量，納米金粒子越多，銀沉積就越多，同時納米金粒徑又會影響納米金粒子的催化活性，通常小粒徑納米金比大粒徑納米金具有更好的催化活性，因此選擇合適的納米金沉積條件，可顯著提高傳感器響應(yīng)性能。

考察了ATCl的濃度對銀溶出電流的影響（圖6a），隨著ATCl濃度的增大，銀溶出電流先增大后減小，當?shù)孜餄舛葹? mmol/L時溶出電流最大。這可能是由于ATCl的濃度增大使生成硫代膽堿的量增多，還原生成的納米金粒子增多，在納米金表面上催化電沉積銀的量增多。當ATCl的濃度超過3 mmol/L，還原生成的納米金粒子可能主要在原來的納米金粒子表面長大，使粒徑增加，但總的納米金粒子數(shù)量沒有增加，導(dǎo)致催化電沉積在納米金粒子上銀的量反而減小。因此，ATCl的最佳濃度選擇為3 mmol/L。

催化反應(yīng)時間是影響納米金生成的另一個重要因素，隨著納米金生液反應(yīng)時間延長，銀溶出電流先增大后減小，當反應(yīng)時間為15 min時，銀溶出電流達到最大（圖6b），其原理類似ATCl濃度變化對納米金生成的影響。因此選擇15 min為最佳納米金生成時間。

方法對馬拉硫磷的檢測有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

采用本電極對湘江水進行檢測，未檢測出有機磷農(nóng)藥。故采用加標回收法進行實驗驗證該傳感器的準確性，每一樣品平行測定5次，測得結(jié)果如表1所示，回收率在95.5%-102.2%。

4結(jié)論

基于生物催化生成納米金和納米金催化銀沉積兩個階段，實現(xiàn)了對有機磷農(nóng)藥的高靈敏檢測。在沒有納米金種子的情況下催化生成納米金顆粒，為了再次實現(xiàn)信號放大，降低背景電流，于

Symbolm@@ 0.10 V的電壓下在生成的納米金顆粒表面電沉積銀，最后采用高靈敏的溶出伏安法對電沉積的銀定量檢測。本方法具有高靈敏度和低檢測背景的特點，可實現(xiàn)低濃度有機磷農(nóng)藥的檢測。

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