1引言

L苯丙氨酸（Phe）是人體8種必需氨基酸之一，在多種疾病的診斷治療和病理學研究上具有重要意義^[1-3]。目前測定Phe的方法有高效液相色譜法^[4]、氣相色譜質(zhì)譜法^[5]、電化學法^[6]等，但這些方法存在靈敏度不高、選擇性不好、儀器昂貴等問題。

電致化學發(fā)光法（ECL）因其靈敏度高、儀器簡單、檢測快速等優(yōu)點，已被應用于氨基酸的檢測^[7，8]。三聯(lián)吡啶釕（Ru（bpy）2+3）是目前應用最廣泛的發(fā)光試劑。由于Ru（bpy）2+3參與化學反應前后的形態(tài)和性質(zhì)基本保持不變，將其固定到電極上反復使用，不僅節(jié)約了試劑，有效降低了檢測成本，還簡化了實驗裝置^[9-11]。

分子印跡聚合物（MIP）對目標分子具有良好的特異性識別的能力，已被廣泛應用于化學、生物等諸多研究領(lǐng)域。溶膠凝膠法制得的印跡傳感器具有物化性質(zhì)穩(wěn)定，檢測快速且操作簡便等優(yōu)點^[12]。已有文獻報道用該印跡傳感器測定血漿樣品中的L苯丙氨酸，檢出限為1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L^[13]。

將電致化學發(fā)光和分子印跡技術(shù)相結(jié)合，既可解決電致化學發(fā)光法的選擇性問題，又可有效提高分子印跡傳感器的檢測靈敏度^[14-16]。本研究在Ru（bpy）2+3固相電極上電沉積溶膠凝膠分子印跡膜，制備了一種對Phe的測定兼有高靈敏度和良好選擇性優(yōu)點的傳感器。此傳感器可應用于尿樣中Phe的快速檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1ECL電極制備條件的優(yōu)化

3.1.1ECL電極的電化學和ECL性能碳納米管由于其優(yōu)良的電學性能已被應用于Ru（bpy）2+3的固定化研究^[17]。圖1A是Nafion電極（a）和 ECL電極（b）在含有1.0 ×10

Symbolm@@ 5 mol/L Phe的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線。曲線b的峰電流明顯大于曲線a，說明MWCNTs的引入提高了電極表面的電子傳輸速率。圖1B給出了兩種電極的發(fā)光強度。ECL電極的發(fā)光強度是Nafion電極的9倍，表明MWCNTs能顯著提高方法的靈敏度。

本研究采用烷氧基硅烷作為印跡材料。圖3為電沉積溶膠凝膠印跡膜的循環(huán)伏安圖。隨著掃描圈數(shù)的增加，電極的響應電流降低直至穩(wěn)定，說明ECL電極表面已完全被印跡膜所覆蓋。掃描圈數(shù)影響分子印跡膜的厚度。掃描圈數(shù)越多，膜越厚，而膜太厚不利于模板分子的洗脫，所以本實驗選擇掃描圈數(shù)為25。

采用掃描電子顯微鏡觀察了不同修飾電極的表面形貌。圖4A為ECL電極的SEM圖，MWCNTs外徑約為20-40 nm，分布均勻，并鑲嵌于Nafion膜里及其表面。圖4B為ECLMIP電極的SEM圖，MWCNTs外徑約為35-65 nm，粗略算得印跡膜的厚度為15-25 nm。

3.3模板分子的洗脫

模板分子通過非共價鍵與功能單體、交聯(lián)劑結(jié)合形成印跡聚合物。這種結(jié)合方法的洗脫較溫和。試驗了熱水，無水乙醇，0.01 mol/L NaOH溶液和44% 甲酸洗脫模板分子Phe。結(jié)果表明，熱水洗脫Phe的過程很緩慢；無水乙醇會溶解分子印跡膜；0.01 mol/L NaOH溶液也會破壞分子印跡膜的完整性，而44%甲酸能快速洗脫模板分子。但由于甲酸濃度太高，易使膜整體脫落。所以本實驗選用44% 甲酸和水交替浸泡電極。隨著洗脫時間的增加，ECL值逐漸減小，4 h后發(fā)光值已接近基線，說明模板分子已洗脫完全。

3.4ECLMIP傳感器的電化學性能

圖5為不同電極在K3[Fe（CN）6]溶液中的循環(huán)伏安曲線。模板分子洗脫前，電極在溶液中幾乎不導電（曲線a），說明電極表面被致密的印跡膜所覆蓋。隨著洗脫過程的進行，K3[Fe（CN）6] 的峰電流逐漸增大，直至不再變化，此時模板分子已洗脫完全（曲線b）。對比曲線b和c可知，ECLMIP電極的導電能力不及ECL電極。K3[Fe（CN）6]可自由通過分子印跡膜中的孔穴，但大部分電極仍被不導電的分子印跡膜所覆蓋，致使K3[Fe（CN）6] 對ECLMIP電極的電化學響應降低。

[TS（][HT5”SS]圖5不同電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]中的循環(huán)伏安圖 （a） ECLPhe MIP電極，（b） ECLMIP電極，（c） ECL電極， 掃速：100 mV/s

Fig.5CVs of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe（CN）6] （a） ECLLphenylalanine （Phe）MIP electrode； （b） ECLMIP electrode； （c） ECL electrode scan rate： 100 mV/s.[HT5][TS）]

3.5ECLMIP傳感器的電致化學發(fā)光性能

為了驗證傳感器是否能對Phe有效響應，測定了Phe的電致化學發(fā)光性能。在電位1.02 V時開始出現(xiàn)發(fā)光現(xiàn)象，隨后發(fā)光迅速增大，達到最大值時電位為1.14 V，該電位與圖1A曲線b的Ru（bpy）2+3氧化峰電位一致?；赑he對Ru（bpy）2+3的電致化學發(fā)光強度的增強作用，可建立檢測Phe的電致化學發(fā)光分析法。

3.6測定條件的優(yōu)化

考察了緩沖溶液的pH值對ECL強度的影響。溶液呈酸性時，ECL值隨pH值的遞增而不斷增大，pH 7.0 時達到最大值。溶液呈堿性時，發(fā)光值未明顯遞減，但空白發(fā)光增大，干擾Phe的檢測。本實驗選擇pH 7.0作為最優(yōu)pH值。

印跡膜中存在著許多孔穴，孔穴的內(nèi)壁上分布著對模板分子具有特異識別性能的結(jié)合位點。實驗發(fā)現(xiàn)，在10-120 s范圍內(nèi)，ECL值隨富集時間的增長而增大；當富集時間大于120 s后，ECL值基本保持不變。表明電極對Phe的吸附已達到平衡，所以選擇富集時間為120 s。

3.7線性范圍和檢出限

3.9傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

考察了傳感器對同一濃度Phe的重現(xiàn)性。將傳感器置于待測溶液中富集、掃描后，取出繼續(xù)洗脫10 min，可使電極恢復原來的響應狀態(tài)。用同一個傳感器平行測定1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液5次，相對標準偏差（RSD）為4.3%；用同樣方法制備的3支傳感器檢測1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液，RSD為4.7%，表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。為了考察其長期穩(wěn)定性，將新制備的傳感器洗脫完全后（4 ℃下保存），每星期測定一次1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液。結(jié)果表明，前兩周測定的ECL值基本穩(wěn)定（RSD<5%），但3星期后發(fā)光強度出現(xiàn)較為明顯減弱。其原因可能與發(fā)光物質(zhì)的溶出有關(guān)，傳感器的長期穩(wěn)定性有待進一步改進。

3.10樣品測定

References

1YANG ShaoMing， LIN HanFeng， JIANG XiuMing， CHEN ZhiChun， LIN XianFu. Journal of Instrumental Analysis， 2003， 22（6）： 113-117

楊紹明，林漢楓，江秀明，陳志春，林賢福. 分析測試學報，2003， 22（6）： 113-117

2Parra M J A， Mateos A A， Mata M M， de María C G. Talanta， 1998， 47（1）： 121-126

3BI PengYu， DONG HuiRu， YU HongBin， CHANG Lin. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（5）： 658-662

畢鵬禹，董慧茹，于宏斌，常 林. 分析化學，2008， 36（5）： 658-662

4WEN JiangPing， TANG AiGuo. Chinese Journal of Chromatography， 2003， 21（2）： 154-157

文江平，唐愛國. 色譜， 2003， 21（2）： 154-157

5Laurens J B， Mbianda X Y， Ubbink J B， Vermaak W J H. J. Chromatogr. B.， 2001， 762（2）： 127-136

6Peng H， Zhang Y Y， Zhang J Z， Xie Q J， Nie L H， Yao S Z. Analyst， 2001， 126（2）： 189-194

7Wang S W， Yu J H， Wan F W， Ge S G， Yan M， Zhang M. Anal. Methods， 2011， 3（5）： 1163-1167

8Liang H， Xue J， Li T， Wu Y Y. Luminescence， 2005， 20（45）： 287-291

9Lin Z J， Chen X M， Jia T T， Wang X D， Xie Z X， Oyama M， Chen X. Anal. Chem.， 2009， 81（2）： 830-833

10Song H J， Zhang Z J， Wang F. Electroanalysis， 2006， 18（18）： 1838-1841

11Wang X Y， Yun W， Dong P， Zhou J M， He P G， Fang Y Z. Langmuir， 2008， 24（5）： 2200-2205

12Deepa P N， Kanungo M， Claycomb G， Sherwood P M A， Collinson M M. Anal. Chem.， 2003， 75（20）： 5399-5405

13Hu Y F， Zhang Z H， Zhang H B， Luo L J， Yao S Z. Talanta， 2011， 84（2）： 305-313

14Lu J J， Ge S G， Wan F W， Yu J H. J. Sep. Sci.， 2012， 35（2）： 320-326

15Li J P， Li S H， Wei X P， Tao H L， Pan H C. Anal. Chem.， 2012， 84（22）： 9951-9955

16Wu B W， Wang Z H， Xue Z H， Zhou X B， Du J， Liu X H， Lu X Q. Analyst， 2012， 137（16）： 3644-3652

17Lin Z Y， Chen G N. Talanta， 2006， 70 （1）： 111-115

18Yi C Q， Tao Y， Wang B， Chen X. Anal. Chim. Acta， 2005， 541（12）： 75-83

19Martin C R， Rubinstein I， Bard A J. J. Am. Chem. Soc.， 1982， 104（18）： 4817-4824