1引言

糖類在生物體中起著極其重要的作用。它涉及生物學(xué)及病理學(xué)過程，如信號傳導(dǎo)、細(xì)胞粘附、癌癥轉(zhuǎn)移等過程，也是生物體進(jìn)行新陳代謝所需能量的主要來源^[1-3]。因此，分析檢測糖類化合物顯得十分重要。目前，已報(bào)道的糖類化合物分析方法有電化學(xué)法^[4]、電化學(xué)發(fā)光法^[5]、熒光法^[6]、石英晶體微天平法^[7]、表面等離子體共振法^[8]等。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)（EIS）是利用小幅度交流電壓或電流對電極擾動，測量體系對擾動跟隨情況的電化學(xué)響應(yīng)的測量方法。該方法具有頻率范圍廣、對體系擾動小等特點(diǎn)，是研究電極過程動力學(xué)、電極表面現(xiàn)象等的重要工具^[9，10]。

目前，糖類化合物的檢測主要基于糖和與糖可結(jié)合分子（如糖結(jié)合蛋白、凝集素、硼酸基團(tuán)等）之間的弱相互作用^[11-13]。硼酸及其衍生物能與二醇可逆高效地共價(jià)結(jié)合而形成環(huán)狀的硼酸酯，因此可將其作為生物傳感器的分子探針來識別糖類化合物^[14-16]。相比糖傳感器的其它識別單元，硼酸具有價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好、易可逆再生等優(yōu)點(diǎn)^[17]。已報(bào)道的作為分子識別物質(zhì)檢測糖的硼酸有苯硼酸、氨基苯硼酸、巰基苯硼酸等^{[18，19]}，其中巰基苯硼酸因易在空氣中氧化、室溫下不穩(wěn)定等缺點(diǎn)在生物傳感應(yīng)用方面受到限制。合成穩(wěn)定的硼酸類衍生物作為糖傳感器的識別單元是糖傳感器研究的一個方向^[20]。

本研究選擇苯硼酸為糖的識別物質(zhì)，首先由半胱胺與4甲酰基苯硼酸反應(yīng)合成Schiff′s堿，通過自組裝方式將合成的硼酸Schiff′s堿固定于金電極表面，以電化學(xué)交流阻抗法為檢測技術(shù)，構(gòu)建非標(biāo)記、靈敏度高、穩(wěn)定性好的電化學(xué)交流阻抗糖傳感器。電極上固定的硼酸可與糖化合物上的二醇可逆、高效地共價(jià)結(jié)合形成環(huán)狀的硼酸酯，利用傳感器與糖結(jié)合前后阻抗值的變化，分析檢測葡萄糖、乳糖和甘露聚糖，并且分別考察傳感器與3種糖的結(jié)合能力。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

電化學(xué)系統(tǒng)為CHI 660電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器公司），電極為三電極體系：工作電極為金電極（Φ=2 mm）或修飾電極，對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl（飽和KCl）電極。

半胱胺（Cysteamine，CA，Mw=77.15 g/mol）、甘露聚糖（Mannan from Saccharomyces cerevisiae，Mw =46000 Da）和4甲?；脚鹚幔?Formylphenylboronic acid，BA，Mr=149.94 g/mol），均購自SigmaAldrich公司。乳糖（C12H22O11·H2O，天津市化學(xué)試劑一廠）。葡萄糖（C6H12O6·H2O，西安化學(xué)試劑廠）。其余所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用水為MilliQ超純水（

18.2 MΩ cm，Millipore公司）。

0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）。0.2 mol/L半胱胺溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.1543 g半胱胺，以超純水溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，避光保存?zhèn)溆谩?.2 mol/L 4甲?；脚鹚崛芤旱呐渲疲簻?zhǔn)確稱取0.3000 g 4甲酰基苯硼酸，用5 mL無水乙醇溶解后，加入5 mL碳酸鹽緩沖液（pH 9.0）定容至10 mL容量瓶備用。葡萄糖、乳糖、甘露聚糖儲備液均由0.1 mol/L PBS（pH 7.4）配制，其中葡萄糖的儲備液需放置24 h后使用。不同pH值的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]K4[Fe（CN）6]檢測溶液分別用不同pH值的0.1 mol/L PBS配制。

2.2電化學(xué)糖傳感器的構(gòu)建

傳感器的構(gòu)建步驟如圖1所示。（1）Schiff′s堿（BACA）的制備移取5 mL 0.2 mol/L半胱胺水溶液于圓底燒瓶中，向其中逐滴加入5 mL 0.2 mol/L 4甲?；脚鹚崛芤海?0 ℃水浴反應(yīng)2 h，得到淡黃色沉淀，過濾，洗滌，干燥，得到Schiff′s堿（BACA）^[21]。Schiff′s堿的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)如下：1H NMR（300 MHz，CD3OD），δ=3.90（s，4H，CH2CH2）， δ=8.32（s，1H，N=CH）， δ=7.43-7.48（s，4H，ArH）。準(zhǔn)確稱取0.0400 g Schiff′s堿（BACA），溶于1 mL無水乙醇中，制得0.04 g/mLSchiff′s堿儲備溶液。（2）糖傳感器的制備金電極的預(yù)處理：將金電極用0.03 μm Al2O3溶膠研磨，然后依次用乙醇、超純水分別超聲清洗5 min，再將金電極在0.1 mol/L H2SO4溶液中，0 - 1.5 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線，用超純水淋洗后備用。將預(yù)處理好的金電極浸入0.04 g/mL Schiff′s堿的溶液中，室溫下組裝4 h，用大量0.01 mol/L PBS沖洗，制備獲得苯硼酸修飾糖傳感器（BACA/Au），將傳感器置于4 ℃冰箱中保存待用。

[TS（][HT5”SS]圖1苯硼酸電化學(xué)交流阻抗傳感器的制備和檢測糖原理圖

Fig.1Schematic representation of phenylboronic acidbased electrochemical sensor for determination of saccharide[HT5][TS）]

分 析 化 學(xué)第41卷

第10期李叢叢等： 以苯硼酸為識別物質(zhì)的電化學(xué)阻抗糖傳感器的制備

2.3電化學(xué)測定

3結(jié)果和討論

3.1傳感器的電化學(xué)交流阻抗法表征

3.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.2.1組裝時(shí)間和結(jié)合時(shí)間的選擇巰基組裝時(shí)間對傳感器電化學(xué)交流阻抗值的影響見圖3A。在0.5-4.0 h之間改變組裝時(shí)間，傳感器結(jié)合435 nmol/L甘露聚糖1 h前后電子傳遞阻抗變化當(dāng)平衡電對溶液pH=9.5時(shí)，苯硼酸修飾電極的阻抗值達(dá)到最大。這主要是苯硼酸基團(tuán)以中性或帶負(fù)電荷的陰離子形式存在，其pKa≈9.0 [14]。苯硼酸與4.35 nmol/L甘露聚糖結(jié)合后在不同pH值的平衡電對中的阻抗變化如圖4b所示，當(dāng)平衡電對pH=9.0時(shí)，阻抗值最大，相比苯硼酸修飾電極的最佳pH值有所降低，與文獻(xiàn)[14，22]一致。為了使傳感器結(jié)合糖前后硼酸與硼酸酯基團(tuán)所帶電荷引起的阻抗差別最大，選擇pH=9.0的K3[Fe（CN）6]K4[Fe（CN）6]平衡電對溶液作為檢測溶液。

3.3電化學(xué)糖傳感器的分析特性

3.3.1傳感器與糖結(jié)合常數(shù)的計(jì)算根據(jù)Szymanska的報(bào)道^[25]，利用EIS技術(shù)，依據(jù)公式（1）和（2）計(jì)算傳感器與糖的結(jié)合常數(shù)。在一定濃度范圍內(nèi)，lg（ΔRet

3.3.2線性范圍和檢出限在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用糖傳感器分別對葡萄糖、乳糖及甘露聚糖進(jìn)行測定。圖6為糖傳感器分別結(jié)合不同濃度的3種糖的Nyquist阻抗圖譜和線性關(guān)系。電子傳遞電

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