1引言

近年來，由不當(dāng)使用或?yàn)E用藥物導(dǎo)致牛奶中的抗生素殘留超標(biāo)引起的乳制品安全問題屢有報(bào)道^[1，2]?？股貧埩舨粌H會(huì)影響乳品質(zhì)量^[3，4]，且長期食用將造成消費(fèi)者的過敏反應(yīng)、產(chǎn)生耐藥性菌株等多種危害^[5]。我國乳制品質(zhì)量和安全已成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。研發(fā)多種（多類）抗生素殘留同時(shí)、快速、高靈敏分析方法，對(duì)提升乳制品中藥物殘留的檢測水平和監(jiān)管力度有重大意義。

常用抗生素殘留檢測方法主要有微生物法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）等^[6-9]。其中，LCMS/MS的靈敏度高、選擇性好，且無需衍生化，是多殘留分析最有力的手段之一。已有同時(shí)檢測魚肉、蜂蜜、牛奶中磺胺、大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素、喹諾酮等多種類藥物殘留等研究報(bào)道^[10-12]。由于藥物理化性質(zhì)的差異性，樣品前處理方法需適用于較寬范圍的化合物，例如直接稀釋樣品或以復(fù)合型的固相萃取柱（Solid phase extraction， SPE）凈化和富集。前者未除去雜質(zhì)、基質(zhì)干擾較大、影響靈敏度；后者不僅耗時(shí)、耗溶劑，且需要預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的SPE柱。

中空纖維液相微萃?。℉FLPME）是一種利用中空纖維的微孔限制大分子不能進(jìn)入萃取相，從而減少基質(zhì)干擾的微萃取技術(shù)。目前，HFLPME已在環(huán)境^[13，14]、生物^[15，16]樣品痕量物質(zhì)分析中有良好的應(yīng)用。然而，已有的HFLPME技術(shù)中待分析組分主要依靠被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)入萃取相，導(dǎo)致傳質(zhì)速率低，平衡時(shí)間長，且分析物無法快速從樣品基體中游離出來，萃取過程常耗費(fèi)數(shù)小時(shí)^[14，16]。

本研究將微波輔助萃?。∕icrowave extraction， MAE）技術(shù)與HFLPME技術(shù)相結(jié)合^[17]，利用微波對(duì)微觀粒子瞬時(shí)極化所帶來的大量熱能和快速傳質(zhì)，達(dá)到縮短HFLPME平衡時(shí)間、提高萃取效率的目的。實(shí)驗(yàn)比較了MAE和普通HFLPME的萃取性能差異，考察了各個(gè)影響因素對(duì)萃取效果影響。微波輔助HFLPME不僅將萃取時(shí)間縮短至普通HFLPME的1/5，而且能大幅提高了藥物的富集效果，對(duì)于牛奶樣品而言僅需沉淀蛋白質(zhì)即可直接萃取。適用于同時(shí)分析牛奶中喹諾酮、磺胺、大環(huán)內(nèi)酯等27種抗生素殘留，方法簡便、快速且環(huán)保。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

API5000型四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（美國AB公司）； Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent Eclipse Poroshell C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm i.d.，2.7

SymbolmA@ m，美國Agilent公司）；漩渦振蕩混合器（美國Thermo公司）；冷凍離心機(jī)（最大轉(zhuǎn)速14000 r/min，美國Sigma公司）； FR300L型手壓封口機(jī)（溫州市鹿城焊接廠）；901型磁力攪拌器（上海司樂儀器公司）；MR HeiTec型磁力攪拌器（Heidolph Instruments公司）；美的微波爐（EG823MF7NRHJDXX，最大輸出功率800 W）； Gilson移液器（可調(diào)范圍：10-100 μL， 20-200 μL， 10-1000 μL， 1000-5000 μL，法國Gilson公司），聚偏氟乙烯中空纖維（內(nèi)徑1.2 mm，壁厚200 μm，孔徑0.2 μm，天津工業(yè)大學(xué)）。

西諾沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、氟羅沙星、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲基異惡唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度95%

Symbol-A@ 99%，美國Sigma Aldrich 公司）；麻保沙星、培氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲惡唑、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺二甲異惡唑、甲氧芐氨嘧啶、克林霉素、林可霉素、竹桃霉素（純度95%

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于燒杯中，加入少量甲醇或乙腈，待完全溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL棕色容量瓶，并用溶劑定容，配制成500.0 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液。按藥物分類，移取各個(gè)單標(biāo)儲(chǔ)備液制備成10.0 mg/L 分組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲(chǔ)備液均置于

Symbolm@@ 30 ℃避光保存。移取各分組混標(biāo)溶液配制成濃度為1.0 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并按需要逐級(jí)稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3色譜質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件如下： 正離子模式（ESI+）下噴霧電壓為5500 V，霧化氣壓力276 kPa（GS1，40 psi），去溶劑氣壓力483 kPa（GS2，70 psi），氣簾氣壓力為241.5 kPa （CUR，35 psi），碰撞氣壓力為41.4 kPa（CAD，6 psi），離子源溫度為500 ℃。

液相條件如下： A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液。色譜流速為250 μL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL。梯度洗脫程序?yàn)椋?0.0 min （5% B）→14.0 min （95% B）→18.0 min （95% B）→19.0 min （5% B）→25.0 min（5% B）。

2.4HFLPME實(shí)驗(yàn)方法

將中空纖維管剪成長度約5 cm小段，分別用甲醇水（1∶1， V/V）和丙酮超聲清洗并晾干，將一端封口。將中空纖維管浸入正辛醇/甲苯溶液中超聲10 min，再用微量注射器將管腔內(nèi)的溶劑吸出，僅使管壁及微孔充滿溶劑，然后用注射器準(zhǔn)確吸取50 μL 正辛醇甲苯溶液，重新注入管腔內(nèi)，再將管口熱封。將中空纖維管一端固定于硅膠片，使裝有溶劑的一端全部浸沒于樣品溶液中，再將樣品瓶置于微波爐反應(yīng)室。微波輔助HFLPME裝置如圖1所示。

設(shè)置微波功率為400 W，磁力攪拌為700 r/min，交替處理。微波程序如下：0.0 min→0.17 min （MW）→3.17 min（無MW）→3.33 min（MW）→6.33 min（無MW）→6.5 min （MW）→9.5 min（無MW）→9.67 min （MW）→12.67 min（無MW）。萃取完成，以微量注射器完全吸取管內(nèi)溶劑，氮?dú)獯蹈桑约状妓?∶4， V/V）溶液重新溶解并定容至100 μL，供LCMS/MS測定。

2.5樣品前處理

稱取牛奶樣品15.0 g于50 mL螺旋蓋聚丙烯離心管，加入1.5 g三氯乙酸，渦旋混勻30 s后，在4 ℃，14000 r/min下離心10 min。收集上清液并用5.0 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，渦旋混勻30 s，再在4 ℃， 14000 r/min離心10 min，吸取10 mL上清液于樣品瓶中，待萃取。[TS（][HT5”SS]圖1微波輔助HFLPME裝置示意圖

Fig.1Schematic diagram of microwave assisted hollow fiberliquid phase microextraction （HFLPME） device[HT5][TS）]

3結(jié)果討論

3.1微波輔助HFLPME的方法建立

3.1.1萃取溶劑的選擇以接受相中分析物的最終濃度與萃取前供相中分析物的初始濃度之比定義富集因子（EF）^[14]。 實(shí)驗(yàn)分別考察了甲苯、正辛醇、正辛醇甲苯（1∶2， V/V）、正辛醇甲苯（1∶1， V/V）、正辛醇甲苯（1∶2， V/V）對(duì)27種化合物萃取效果的影響，如圖2所示。通過分析27種化合物的EF發(fā)現(xiàn)，正辛醇或正辛醇比例高的溶劑對(duì)弱極性藥物如氧氟沙星、諾氟沙星等喹諾酮類藥物的萃取效果較差；甲苯以及正辛醇/甲苯（1∶2， V/V）的總體萃取效果較差，原因在于甲苯揮發(fā)性較大，萃取過程損失較多而影響了藥物的EF；正辛醇與甲苯的混合溶劑較單一使用正辛醇萃取低極性藥物EF有顯著提高。通過優(yōu)化甲苯與正辛醇比例，發(fā)現(xiàn)正辛醇甲苯（1∶2， V/V）作為接受相的有機(jī)溶劑時(shí)，絕大部分目標(biāo)化合物可以獲得最大EF，因此選擇正辛醇甲苯（1∶2， V/V）作為優(yōu)化溶劑。

3.1.2微波輻照功率的影響

分別施加80， 240， 400， 640和800 W的微波功率考察HFLPME對(duì)27種目標(biāo)化合物的萃取效果。 結(jié)果表明，隨著微波功率從80 W增加至400 W，大部分化合物的EF顯著提高。當(dāng)功率增加至640 和800 W時(shí)，部分化合物EF反而迅速下降。這是由于微波輻照作用下樣品溶液中的微觀粒子瞬時(shí)極化的摩擦、碰撞以及將帶來的大量熱能共同作用下，促使傳質(zhì)速度的提高，目標(biāo)化合物充分更容易從基體中出來， 進(jìn)入萃取相^[18-20]。當(dāng)微波輻照功率大于640 W，整個(gè)萃取體系溫度在短時(shí)間內(nèi)快速上升，有機(jī)相因?yàn)閾]發(fā)過快，導(dǎo)致大部分化合物EF降低^[20]。因此，選擇微波輻照功率為400 W。

3.1.3微波輻照時(shí)間的影響為避免由溫度升高過快造成的萃取溶劑損失，實(shí)驗(yàn)通過間歇微波輻照控制體系溫度45

Symbol-A@ 50℃。微波輻照功率400 W，輻照時(shí)間10 s，間隔3 min無微波，萃取時(shí)間13.0 min中分別包含微波輻照時(shí)間為0.17， 0.33， 0.5， 0.67， 0.83和1.0 min時(shí)的萃取效果。如0.5 min微波輻照時(shí)間的微波程序如下：0.0 min→0.17 min（MW）→3.17 min（無MW）→3.33 min（MW）→6.33 min（無MW）→6.5 min（MW）→13.0 min（無MW）。圖3可知輻照時(shí)間在0.17-0.5 min，EF未見顯著增加；隨著輻照時(shí)間增加至0.67 min，EF顯著提高；當(dāng)輻照時(shí)間增加至1.0 min，富集效果隨著時(shí)間增加而下降。其原因可能微波輻照時(shí)間作用與微波功率相似，在提高萃取效率同時(shí)也使體系溫度升高，萃取溶劑易揮發(fā)使得EF下降。綜合考慮， 微波輻照時(shí)間選擇為0.67 min。

[TS（][HT5”SS]圖3微波輻照時(shí)間對(duì)富集效果的影響（化合物編號(hào)同附表1）

Fig 3.Effect of microwave irradiation time on the EF （Compounds number was the same as in attached Table 1）[HT5][TS）]

3.1.4離子強(qiáng)度的影響

供相溶液加入鹽（常用NaCl）與水分子形成水合離子，能減少目標(biāo)化合物與水分子結(jié)合，使目標(biāo)化合物更容易被接受相富集。但同時(shí)離子與化合物可能產(chǎn)生靜電作用，影響萃取效果^[9，11]。實(shí)驗(yàn)考察了NaCl濃度分別為0%， 5%， 15%， 25%， 35%（w/V）時(shí)27種化合物的萃取效果。結(jié)果表明，NaCl濃度為15%對(duì)喹諾酮類藥物的萃取最有利，25%

Symbol-A@ 35% NaCl適合于磺胺類藥物萃取，25%NaCl對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物有最好的萃取效果。因此NaCl濃度選擇為25%時(shí)，可使得大多數(shù)化合物有較好的萃取效果。

3.1.5攪拌速度的影響

考察27種化合物在攪拌速度300-1100 r/min時(shí)的萃取效果。結(jié)果表明，當(dāng)攪拌速度為300-700 r/min時(shí)，大部分化合物EF隨著攪拌速度提高而增加；攪拌速度大于700 r/min，EF隨著攪拌速度提高而減少。分析其原因在于加速攪拌雖然可以加速傳質(zhì)，使中空纖維管外的溶液層不斷更新提高萃取效率；但是攪拌速度過高， 容易產(chǎn)生氣泡， 阻礙兩相間傳質(zhì)，導(dǎo)致大部分藥物的EF降低^[9]。實(shí)驗(yàn)選擇的攪拌速度為700 r/min。

3.1.6沉淀蛋白質(zhì)的方法研究

考察了鹽析法和有機(jī)試劑沉淀法去除牛奶中蛋白質(zhì)的效果。液體奶樣中加入NaCl鹽析，經(jīng)渦旋混勻后高速離心，仍有懸浮絮狀物。有機(jī)試劑沉淀法中考察了36%乙酸、N，N二甲基甲酰胺、三氯甲烷、乙腈和三氯乙酸。結(jié)果表明，36%乙酸、N，N二甲基甲酰胺和三氯甲烷無法完全沉淀蛋白質(zhì)；乙腈能有效沉淀蛋白質(zhì)，但對(duì)藥物的萃取作用導(dǎo)致部分藥物回收率低；三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)效果最好，且大部分藥物的損失最小，選擇為蛋白沉淀劑。

3.2微波輔助與普通HFLPME萃取性能比較

以27種藥物中EF處于中位值的4種化合物繪制萃取時(shí)間曲線圖（圖4）。微波輔助HFLPME萃取程序如下：微波輻照10 s，間隔3 min無微波，萃取時(shí)間為3.17， 6.33， 9.5， 12.67， 15.83和19.0 min，其中微波輻照時(shí)間為0.17， 0.33， 0.5， 0.67， 0.83和1.0 min（圖4a）。普通HFLPME的萃取時(shí)間為10， 20， 40， 60， 80， 100和120 min（圖4b）。普通HFLPME中多數(shù)藥物的最佳萃取時(shí)間為60 min，微波輔助HFLPME在12.67 min時(shí)大部分藥物的EF最大。比較兩種萃取方式在各自最佳萃取條件下的EF（附表1， 見網(wǎng)絡(luò)版），結(jié)果顯示普通HFLPME獲得的最大EF為12.5（磺胺鄰二甲氧嘧啶），另有50%以上藥物的EF<1，其中諾氟沙星、洛美沙星和麻保沙星5種藥物幾乎未被富集。微波輔助HFLPME萃取27種藥物的最大EF=18.1（麻保沙星），最小EF=1.2（磺胺二甲異嘧啶），EF較普通HFLPME提高數(shù)倍至數(shù)十倍。由于27種化合物多為中等極性，另外極性較強(qiáng)的化合物，如麻保沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、甲氧芐氨嘧啶等化合物無法被普通HFLPME萃取富集。微波輔助比普通HFLPME的主要優(yōu)勢在于大大縮短萃取時(shí)間、提升富集效果，且能夠促進(jìn)透過中空纖維微孔被萃取富集，使富集倍數(shù)顯著提升。

根據(jù)27種化合物的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI+電離模式。通過一級(jí)質(zhì)譜全掃描（Full scan），確定其準(zhǔn)分子離子，再以氮?dú)馀鲎伯a(chǎn)生的碎片離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描（Product ion），選擇豐度較高的兩個(gè)碎片離子作為定性和定量離子。優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）及碰撞室出口電壓（CXP）， 以提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式優(yōu)化各種質(zhì)譜離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力。采用Analyst 1.5.2軟件，在各個(gè)離子保留時(shí)間的前后各100 s的時(shí)間窗口內(nèi)采集該對(duì)離子。選擇甲醇和水添加0.1%甲酸作為分離流動(dòng)相。表1列出了部分化合物的定性/定量離子對(duì)、保留時(shí)間和優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)（附表1列出27種化合物的質(zhì)譜參數(shù)）。

3.4分析方法的評(píng)價(jià)

3.4.1方法的線性范圍、 檢出限和定量限采用基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量，即用空白樣品提取液配制濃度分別為0， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0和5.0 μg/L的加標(biāo)樣品溶液，在優(yōu)化條件下萃取，以定量離子峰面積對(duì)各目標(biāo)分析物的濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，所得相關(guān)系數(shù)r>0.99。根據(jù)3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表2，重構(gòu)離子色譜圖見圖5。

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