摘要[HTSS]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF/TOF）高置信度地鑒定了枯草芽孢桿菌中的蛋白酶抑制劑和桿菌肽F兩種蛋白及其翻譯后修飾，發(fā)現(xiàn)在這兩種蛋白質(zhì)中共有5個(gè)肽段發(fā)生谷氨酸甲基化，其中肽段FELVVYDSEHK存在FE（Methylation）LVVYDSEHK和FELVVYDSE（Methylation）HK兩種形式。結(jié)果表明，MALDITOF/TOF高能CID所提供的豐富斷裂信息和全質(zhì)量范圍掃描對(duì)提高分析結(jié)果的確定性具有重要作用。此外，這5個(gè)甲基化肽段都可以檢測(cè)到相對(duì)含量更高的非甲基化肽段，這為降低分析結(jié)果的假陽(yáng)性提供了輔助判據(jù)。在低質(zhì)量區(qū)檢測(cè)到甲基化賴氨酸的亞胺相關(guān)離子m/z 98和143，說(shuō)明發(fā)生了賴氨酸的甲基化；檢測(cè)到m/z 116則提示發(fā)生了谷氨酸甲基化。

1引言

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（Posttranslational modifications， PTMs）是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)和多樣化的過(guò)程，與嚴(yán)格的基因表達(dá)調(diào)控方式相比，PTMs更容易創(chuàng)造蛋白質(zhì)性質(zhì)的動(dòng)態(tài)組合庫(kù)，使得生物體能夠快速適應(yīng)各種環(huán)境刺激^[1]，因此，PTMs是蛋白質(zhì)的功能調(diào)控、相互作用和動(dòng)態(tài)反應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)^[2]。PTMs主要包括蛋白質(zhì)的磷酸化、糖基化、泛素、乙?；图谆?，其中蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究開展較早，針對(duì)這兩種化學(xué)修飾蛋白建立了多種特異性分離方法^[3-7]。

目前，對(duì)蛋白質(zhì)的甲基化修飾研究相對(duì)較少。早期研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白賴氨酸與精氨酸殘基的甲基化基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)^[8]。2008年，Sprung等^[9]在人肝癌細(xì)胞和啤酒酵母中檢測(cè)到了天冬氨酸和谷氨酸的甲基化修飾；有研究表明，與正常胰管細(xì)胞相比，在胰腺癌細(xì)胞的α烯醇酶中有更多的天冬氨酸和谷氨酸發(fā)生甲基化，提示這些修飾可能參與了與腫瘤相關(guān)的病理生理過(guò)程^[10]，以上工作均是在靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜（LTQOrbitrap）上完成。目前，尚未見到利用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrixassisted laser desorption ionization tandem timeof flight mass spectrometry， MALDITOF/TOF）分析谷氨酸甲基化的報(bào)道。本研究以枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)一級(jí)質(zhì)譜離子峰豐度的比較和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜的分析，闡明利用MALDITOF/TOF質(zhì)譜分析谷氨酸甲基化的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，提高含甲基化谷氨酸多肽和蛋白的鑒定置信度，為在組學(xué)水平上研究谷氨酸甲基化的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

4800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDITOF/TOF，美國(guó)Applied Biosystems/MDX SCIEX公司），儀器控制軟件為4700 Series Explorer Software；超純水處理系統(tǒng)（ MilliQ，美國(guó)Millipore 公司）；蛋白純化系統(tǒng)（AKTA FPLC，美國(guó)GE公司）；320S型pH計(jì)（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；胰蛋白酶（質(zhì)譜分析級(jí)，Promega公司）；α腈基4羥基肉桂酸（美國(guó)Sigma公司，使用前重結(jié)晶）；乙腈和三氟乙酸等其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。

枯草芽孢桿菌從深圳紅樹林海泥中分離。

2.2膠內(nèi)胰酶水解條件

切膠：將雙向電泳分離后的目標(biāo)條帶用移液槍槍頭切下，小心地放入PCR管；脫色：用100 μL 高純水振蕩洗滌10 min，重復(fù)3次；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；100 μL 25 mmol/L NH4HCO3/50%乙腈室溫振蕩30 min；干燥膠粒：100 μL 25 mmol/L NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min；加100 μL 100%乙腈于膠粒中靜置10 min，重復(fù)1次；酶解：加入5 μL 20 mg/L質(zhì)譜用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，4 ℃放置30 min，使酶液完全浸透膠粒，吸掉多余的酶液；加入5 μL 40 mmol/L NH4HCO3/10% CAN混合液， 37 ℃水浴8 h。

2.3質(zhì)譜分析條件

基質(zhì)制備：將6 g/L α腈基4羥基肉桂酸和2 g/L 檸檬酸氫二胺溶于10 mL 50%乙腈（含0.1%三氟乙酸），基質(zhì)溶液與蛋白酶解液1∶1混合后點(diǎn)于不銹鋼靶版，自然干燥結(jié)晶后待測(cè)。采用正離子反射模式，一級(jí)質(zhì)譜每張譜圖累加800次，二級(jí)質(zhì)譜累加1200次，碰撞誘導(dǎo)解離條件為： 碰撞能加空氣碰撞1 kV（gas on），源內(nèi)電壓8 kV，碰撞池電壓7 kV，二級(jí)源加速電壓15 kV。

2.4數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索條件：串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)信噪比設(shè)為5，一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量誤差均設(shè)為±0.3 Da，Mascot 軟件分析， 搜索數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI 2012年8月發(fā)布，甲硫氨酸氧化和谷氨酸甲基化作為可變修飾。當(dāng)Mascot 分?jǐn)?shù)接近或小于可信閾值時(shí)，利用Data Explorer提供的離子碎片計(jì)算器（Ion fragmentation calculator）和ProteinProspector MSProduct program輔助進(jìn)行人工解析。

3結(jié)果與討論

3.1枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑BsuPI中谷氨酸的甲基化

因?yàn)楣劝彼岬募谆瘜儆诓怀Ｒ姷姆g后修飾，所以最初搜庫(kù)時(shí)未被列入可變修飾中。將搜庫(kù)文件提交到Mascot引擎檢索后，一個(gè)目的蛋白被鑒定為枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑BsuPI，同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在3組分子量相差14 Da的[M+H]+峰，如圖1所示，它們的質(zhì)荷比分別為1303.80，1317.81； 1365.77，1379.82； 2313.34，2327.36，加14 Da的[M+H]+峰的豐度很低且未被數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，這提示可能存在蛋白的甲基化修飾現(xiàn)象。

由于甲基化不引起電荷變化，可以認(rèn)為同一組內(nèi)肽段電離效率相近，離子豐度的高低可以反映其含量的相對(duì)大小，所以這也提示對(duì)某種特定蛋白質(zhì)而言，只有極少部分發(fā)生了甲基化修飾。由于甲基化可能發(fā)生在賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸7種氨基酸殘基上^[9]，并且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性也有可能造成質(zhì)荷比的巧合，所以需進(jìn)一步確認(rèn)。由于數(shù)據(jù)量較小并且串聯(lián)質(zhì)譜的譜圖質(zhì)量較高，先進(jìn)行人工解析。圖2a和圖2b分別為m/z 1365和1379的串聯(lián)質(zhì)譜圖，m/z 1365的鑒定結(jié)果為肽段FELVVYDSEHK。除離子強(qiáng)度外，二者譜圖輪廓非常相似，說(shuō)明它們結(jié)構(gòu)相近，的確發(fā)生了該肽段上氨基酸的甲基化修飾。檢測(cè)到了肽段FELVVYDSEHK的全部互補(bǔ)的b和y系列離子，例如b2，b3離子分別為m/z 277.12，390.19（理論值277.12，390.20），而在圖3上清楚可見m/z 291和404，對(duì)應(yīng)肽段氨基端第二位的谷氨酸（E）上發(fā)生甲基化，檢測(cè)到完整的y1 至y9離子、b10 （m/z 1233）和b10+H2O （m/z 1251）離子也證明該判斷正確。肽段的[M+H]+離子在碰撞誘導(dǎo)解離過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生b+H2O離子的現(xiàn)象最早報(bào)道于1990年，隨后，She等基于串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步研究，提出對(duì)于由n個(gè)氨基酸殘基組成的肽段，如果序列中存在非C端堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸），則在質(zhì)子化側(cè)鏈和第n1個(gè)羰基氧之間可能形成氫鍵，丟失C末端氨基酸和形成新的C末端^[11]，從而形成bn1+H2O離子。因?yàn)殡亩蜦ELVVYDSEHK含有組氨酸且由11個(gè)氨基酸組成，所以圖2和圖3中檢測(cè)到的b10+H2O峰可以用上述機(jī)制解釋。值得注意的是，在圖3的低質(zhì)量區(qū)同樣檢測(cè)到了m/z 277和390離子，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，還存在羧基端第三位谷氨酸甲基化的y3y7離子（用*表示）。因此，串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果表明肽段FELVVYDSEHK的兩個(gè)谷氨酸殘基上分別發(fā)生了甲基化。

3.2枯草芽孢桿菌兩種甲基化蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的樣品來(lái)源是芽孢桿菌蛋白提取液經(jīng)離子交換和分子篩層析分離篩選出的具有生物活性的蛋白，經(jīng)雙向電泳上共獲得6個(gè)蛋白點(diǎn)，將谷氨酸甲基化修飾添加為可變修后搜庫(kù)檢索，共檢測(cè)到兩種蛋白發(fā)生甲基化修飾（表1）。在枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑BsuPI中，肽段QVQAVQQFEVK和MENQEVVLSIDAIQEPEQIK 也存在甲基化現(xiàn)象，匹配分?jǐn)?shù)很高，人工比對(duì)結(jié)果與搜庫(kù)結(jié)果一致。但數(shù)據(jù)庫(kù)檢索只給出了肽段FELVVYDSEHKER的N端第2位谷氨酸發(fā)生甲基化的結(jié)果，這可能是因?yàn)樵撾亩蔚碾x子序列更完整和豐度更高，目前Mascot搜索引擎對(duì)于同一肽段的混合修飾較還難給出精確結(jié)果。此外，在桿菌肽F（Bacillopeptidase F）也觀察到了谷氨酸甲基化修飾現(xiàn)象，與細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑的分析類似，甲基化肽段ATDGVEWNVDQIDAPK和AFSEDGGTDADILEAGEWVLAPK的[M+H]+峰在一級(jí)譜中信號(hào)很弱（相對(duì)強(qiáng)度<4%），但依然能夠給出谷氨酸甲基化的確切信息，甚至可以用于從頭測(cè)序分析。目前，關(guān)于谷氨酸甲基化與蛋白質(zhì)活性、功能和信號(hào)通路之間的關(guān)系的研究還較少，也未見在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白的甲基化修飾報(bào)道，本研究所發(fā)現(xiàn)的這兩種蛋白都屬于酶類，提示谷氨酸的甲基化修飾具有重要的生物學(xué)意義。

目標(biāo)肽段被鑒定為EVAQDFKTELR，在谷氨酸甲基化和賴氨酸甲基化同時(shí)作為可變修飾的條件下目標(biāo)肽段被鑒定為EIAQDFKTDLR，二者的Mascot打分分別為33和53分，都低于p<0.05的閾值，雖然從得分上分析應(yīng)該是后者更為可信，但利用亞胺離子的信息可給出更準(zhǔn)確的結(jié)果。賴氨酸的亞胺離子為m/z 101，但該離子豐度一般很低；相反，賴氨酸亞胺相關(guān)離子m/z 84和129強(qiáng)度較高，在圖3的低質(zhì)量區(qū)明顯觀察到了m/z 98和143離子，這分別對(duì)應(yīng)它們加上14 Da，因此，可以肯定是賴氨酸甲基化。如果是谷氨酸甲基化，則如圖4A和圖4B的對(duì)比所示，將在m/z 116處觀察到明顯區(qū)別于噪音的信號(hào)峰，對(duì)應(yīng)谷氨酸亞胺離子（m/z 102）加上14 Da。相比于組氨酸、脯氨酸和色氨酸等，谷氨酸的亞胺離子強(qiáng)度較弱，并與肽鏈長(zhǎng)短、谷氨酸在肽鏈中的位置、碰撞條件和累積時(shí)間等因素，在本工作中，只有在長(zhǎng)肽段AFSEDGGTDADILEAGEWVLAPK的TOF/TOF譜圖中未檢測(cè)到m/z 116離子。值得注意的是，這種MALDITOF/TOF類型儀器有兩種操作模式：1 kV，Gas on和2 kV， Gas off，二者的區(qū)別在于前者通過(guò)空氣碰撞可以提供豐富的亞胺離子信息，

綜上所述，如果檢測(cè)到分子量相差14Da的離子對(duì)并且大分子量離子的強(qiáng)度明顯偏低，則提示可能發(fā)生了甲基化修飾，如果觀察到m/z 166處的谷氨酸亞胺離子，則可為發(fā)生谷氨酸甲基化提供第一步判據(jù)，修飾位點(diǎn)的最終確定需依賴高質(zhì)量的串聯(lián)質(zhì)譜。另一方面，本文在枯草芽孢桿菌的為細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑BsuPI和桿菌肽F中檢測(cè)到了5個(gè)谷氨酸甲基化肽段，發(fā)現(xiàn)了肽段FELVVYDSEHK中兩個(gè)谷氨酸分別存在甲基化，這不僅為下一步生物學(xué)研究提供了新線索，也說(shuō)明MALDITOF/TOF質(zhì)譜高能CID是研究蛋白質(zhì)甲基化修飾的合適方法。本研究表明，由于肽段不同位置谷氨酸的甲基化修飾而產(chǎn)生同分異構(gòu)體的混合譜是可能的，目前數(shù)據(jù)庫(kù)檢索方法對(duì)這類混合譜尚較難處理，因此與肽段從頭測(cè)序分析的要求類似^[16]，對(duì)搜庫(kù)結(jié)果進(jìn)行手工驗(yàn)證是必要的。

References

1Davis B G. Science， 2004， 303： 480-482

2TAN YongCong， WANG QiJun， ZHAO GuoPing， YAO YuFeng. Progress in Biochemistry and Biophysics， 2011， 38（3）： 197-203

譚永聰， 王啟軍， 趙國(guó)屏， 姚玉峰. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2011， 38（3）： 197-203

3Zhou H J， Ye M L， Dong J， Han G H， Jing X N， Wu R N， Zou H F. J. Proteome. Res. ， 2008， 7（9）： 3957-3967

4Jia W， Luo Z， Fu Y， Wang H P， Wang L H， Chi H， Yuan Z F. Mol. Cell. Proteomics.， 2009， 8（5）： 913-923

5JIANG Jing， HAN HuanHuan， MA Cheng， WANG JiFeng， YING WanTao， QIAN XiaoHong. Chinese J. Anal.Chem.， 2012， 40（7）： 1019-1024

江 靜， 韓歡歡， 馬 成， 王繼峰， 應(yīng)萬(wàn)濤， 錢小紅. 分析化學(xué)， 2012， 40（7）： 1019-1024

6Cheng G， Zhang J L， Liu Y L， Sun D H， Ni J Z. Chem. Commun.， 2011， 47： 5732-5734

7Xu Y W， Wu Z X， Zhang L J， Lu H J， Yang P Y， Webley P A， Zhao D Y. Anal. Chem.， 2009， 81： 505-508

8Strahl B D， Allis C D. Nature， 2000， 403： 41-45

9Sprung R， Chen Y， Zhang K， Cheng D M， Zhang T， Peng J M， Zhao Y M. J. Proteome. Res.， 2008， 7（3）： 1001-1006

10Zhou W D， Capello M， Fredolini C， Piemonti L， Liotta L A， Novelli F， Petricoin E F. J. Proteome. Res.， 2010， 9（6）： 2929-2936

11She Y， Krokhin O， Spicer V， Loboda A， Garland G， Ens W， Standing K G. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2007， 18（6）： 1024-1037

12Medzihradszky K F， Campbell J M， Baldwin M A， Falick A M， Juhasz P， Vestal M L， Burlingame A L. Anal. Chem.， 2000， 72： 552-558

13Vestal M L， Campbell J M. Methods in Enzymology， 2005， 402： 79-107

14Khatun J， Ramkissoon K， Giddings M C. Anal. Chem.， 2007， 79（8）： 3032-3040

15Huang L， Baldwin M A， Maltby D A， Medzihradszky K F， Campbell J， Juhasz P， Martin S A， Vestal M L， Burlingame A L. Mol. Cell. Proteomics， 2002， 1： 434-450

16Seidler J， Zinn N， Boehm M E， Lehmann W D. Proteomics， 2010， 10： 634-649