摘要[HTSS]建立了紅葡萄酒酪蛋白過(guò)敏原的質(zhì)譜分析方法。選擇專一性SRM離子對(duì)，建立3種亞型酪蛋白αS1， αS2， β的質(zhì)譜定性與定量方法；利用交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）處理紅葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，使前處理縮短到2 h以內(nèi)。結(jié)果表明，酪蛋白的回收率提高到80%以上，檢出限達(dá)10 μg/L。

1引言

引起過(guò)敏的物質(zhì)稱為過(guò)敏原，一般為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。隨著食物過(guò)敏患者的增多，以及可能導(dǎo)致過(guò)敏性休克甚至死亡等嚴(yán)重后果，已建立了一系列針對(duì)過(guò)敏原的法規(guī)及檢測(cè)方法，包括核酸法（PCR）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）等。新興的質(zhì)譜法（MS）靈敏度高、假陽(yáng)性概率低，并具有方法開發(fā)快速、運(yùn)行成本低等優(yōu)勢(shì)。

葡萄酒釀造過(guò)程中需要加入澄清劑去除沉淀物質(zhì)，使酒液獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定性。酪蛋白是常用的澄清劑之一。酪蛋白是一種來(lái)源于牛乳的過(guò)敏原，殘留在葡萄酒中會(huì)對(duì)過(guò)敏人群產(chǎn)生危害。但是葡萄酒，特別是紅葡萄酒含有大量單寧等鞣質(zhì)，單寧與蛋白質(zhì)之間存在多點(diǎn)疏水鍵和氫鍵的作用，有很強(qiáng)的蛋白結(jié)合能力。單寧常用作酶抑制劑使酶失活。單寧極大地抑制了葡萄酒蛋白的提取與酶解，傳統(tǒng)蛋白提取方法（超濾、透析、有機(jī)溶劑沉淀等）用于葡萄酒時(shí)回收率只有20%-30%^[1，2]。因此，關(guān)于葡萄酒過(guò)敏原質(zhì)譜分析的報(bào)道很少，研究對(duì)象也集中在單寧含量很低的白葡萄酒，對(duì)于含有大量單寧的紅葡萄酒的前處理和質(zhì)譜分析仍無(wú)成熟的策略^[3，4]。已報(bào)道的方法如十二烷基硫酸鉀（KDS）法、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）法等，提取后蛋白仍需要電泳去除單寧和兩性電解質(zhì)，工作量大，分析通量低，蛋白質(zhì)的回收率很低^[5，6]。

交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）是PVP交聯(lián)后形成的顆粒（約110 μm），具有很強(qiáng)的吸附能力^[7]。PVPP競(jìng)爭(zhēng)性地與單寧結(jié)合，釋放蛋白，可以有效去除單寧等多酚類物質(zhì)^[8，9]。本研究利用PVPP建立了快速、高效的紅葡萄酒蛋白提取與酶解方法，使前處理時(shí)間縮短到2 h之內(nèi)，回收率達(dá)到80%以上。將本方法與三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS/MS）結(jié)合，分析了紅酒中3種亞型的酪蛋白，檢出限達(dá)到10 μg/L，比目前報(bào)道的方法提高了至少一個(gè)數(shù)量級(jí)^[3]。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

TSQ Vantage三重四極桿質(zhì)譜、Ultimate 3000超高效液相色譜（Thermo公司）。α酪蛋白（αCasein）、β酪蛋白（βCasein）、胰蛋白酶（Trypsin）、PVPP、NH4HCO3購(gòu)自SigmaAldrich公司；乙腈、甲酸購(gòu)自Fisher公司；紅葡萄酒商品若干。

2.2蛋白提取與酶解

樣品制備：取紅酒200 μL與酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 μg/L）充分混勻后（添加量為100 μg/L時(shí)），加入200 μL PVPP混懸液（100 g/L，溶于0.5 mol/L NH4HCO3溶液），并于30 ℃振蕩反應(yīng)15 min。反應(yīng)后，直接加入2 μL Trypsin （200 μg/L），并于37 ℃振蕩酶解1.5 h。

酶解完成后，于20000 g離心5 min，取上清液。沉淀加入100 μL水，振蕩超聲2 min，再于20000 g下離心5 min，將溶液完全取出。兩次溶液合并后，再次20000 g離心，取上清液直接進(jìn)樣分析。

對(duì)照品制備：第一步不加酪蛋白，前處理完成后、進(jìn)樣前，再加入Trypsin酶解后的酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 mg/L ，添加量為100 μg/L）， 混勻后直接進(jìn)樣分析。

2.3LCMS/MS分析

第10期張 偉等： 交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮快速前處理方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析紅葡萄酒中酪蛋白過(guò)敏原

2.4數(shù)據(jù)處理

酪蛋白亞型序列來(lái)自SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)； 專一性肽段與特征性碎片選擇及碰撞能量?jī)?yōu)化由PinPoint軟件（Thermo）分析，結(jié)合LTQOrbitrap 高分辨質(zhì)譜（Thermo）全掃描確證獲得； 質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Xcalibur Qual Browser軟件（Thermo）進(jìn)行定性分析，由Xcalibur Quan Browser軟件（Thermo）進(jìn)行定量分析。

3結(jié)果與討論

3.1酪蛋白LCMS/MS方法建立

酪蛋白有α和β兩種主要亞型，其中α包含S1和S2兩種亞型。由于αS1， αS2和β三者序列完全不同，并同時(shí)具有致敏性，因此同時(shí)針對(duì)這3種酪蛋白建立LCMS/MS分析方法。根據(jù)Pinpoint軟件分析，從3種酪蛋白中分別選擇兩條特征性肽段，每條特征性肽段分別選擇兩個(gè)子離子，即每種亞型對(duì)應(yīng)4對(duì)離子對(duì)，并獲得相應(yīng)的優(yōu)化碰撞能量（表1）。為了確定離子對(duì)選擇的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步通過(guò)LTQOrbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行了數(shù)據(jù)依賴性掃描分析，驗(yàn)證了離子對(duì)選擇的合理性（圖1）。

Fig.2SRM total ion chromatogram and extracted ion chromatogram of casein unique peptides[HT5][TS）]

比PCR和ELISA檢測(cè)，LCMS/MS不僅能直接對(duì)目標(biāo)過(guò)敏原進(jìn)行鑒定，還可以同時(shí)分析不同亞型，方法的選擇性、準(zhǔn)確度、通量均有很大提高。

3.2紅葡萄酒快速前處理

利用PVPP實(shí)現(xiàn)了紅葡萄酒高效、快速前處理，并最大程度地降低了蛋白的損失。向紅酒中加入足量的PVPP競(jìng)爭(zhēng)性吸附單寧，再加入過(guò)量的Trypsin快速酶解蛋白，離心取上清液，并重復(fù)一次，合并兩次上清液后直接進(jìn)行質(zhì)譜分析（圖3）。與傳統(tǒng)方法相比，PVPP法不僅使回收率明顯提高，也使前處理時(shí)間由12 h（過(guò)夜酶解）縮短到2 h之內(nèi)。

值得注意的是，PVPP添加量與處理效果并不完全成正比，當(dāng)超過(guò)最優(yōu)添加量時(shí)，質(zhì)譜響應(yīng)反而下降，處理效果變差。這可能與PVPP的比表面積和吸附力有關(guān)：達(dá)到最優(yōu)添加量之前，PVPP在紅酒中均勻分散成小顆粒，比表面積大、吸附力強(qiáng)，有利于酚類物質(zhì)吸附；當(dāng)添加量超過(guò)最優(yōu)值后，PVPP顆粒之間快速團(tuán)聚形成沉淀，吸附能力下降，同時(shí)蛋白也隨酚類物質(zhì)摻雜在沉淀中，難以有效釋放。因此，合適的PVPP添加量對(duì)前處理非常重要。

考察了PVPP法的基質(zhì)效應(yīng)，200 μL紅酒經(jīng)PVPP處理并添加酪蛋白（1 mg/L ）后質(zhì)譜分析，并與等量經(jīng)PVPP處理的空白紅酒基質(zhì)進(jìn)行比較。結(jié)果表明（圖5），基質(zhì)對(duì)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)影響不大（峰面積差異?。瞻谆|(zhì)未見特征肽段的質(zhì)譜響應(yīng)。證明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)無(wú)影響，前處理方法可靠、有效。

效解決了這一難題。

在低濃度下，PVPP法同樣能達(dá)到較高回收率。如表2所示，在0.1 mg/L 酪蛋白（100 μg/L）添加量下，特征性肽段的回收率均可達(dá)到75%以上，肽段ALNEINQFYQK由于響應(yīng)太低，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算回收率。

考察了0.1 mg/L 酪蛋白在4種不同品牌紅酒中的回收率。如表3所示，特征性肽段的回收率均保持在64%-150%之間，進(jìn)一步證明了PVPP用于紅酒酪蛋白快速前處理方法高效、可行。

根據(jù)α酪蛋白中αS1和αS2所占比例計(jì)算，最終確定6條肽段的定量限在10-100 μg/L之間，對(duì)應(yīng)到αS1， αS2和β酪蛋白的定量限分別為40， 40和10 μg/L（表4），比文獻(xiàn)[3] 報(bào)道方法提高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，在10 μg/L濃度下，所有肽段均有響應(yīng)（信噪比>3）， 因此αS1， αS2， β酪蛋白的檢測(cè)限均在10 μg/L以下，同樣比文獻(xiàn)[3]報(bào)道方法提高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4結(jié)論

通過(guò)PVPP快速前處理，使紅酒中酪蛋白回收率提高到80%以上，使整個(gè)前處理時(shí)間縮短到2 h之內(nèi)，有效解決了紅酒中大量單寧對(duì)蛋白提取與酶解的抑制。將PVPP法與三重四極桿液相色譜質(zhì)譜結(jié)合，分析了紅酒中3種亞型的酪蛋白αS1， αS2， β的過(guò)敏原，檢測(cè)限均低至10 μg/L，定量限達(dá)10-40 μg/L，同時(shí)結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。PVPP前處理方法簡(jiǎn)單有效、重現(xiàn)性好，適用于高通量的紅葡萄酒過(guò)敏原檢測(cè)。

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