摘要[HTSS]利用亞臨界1，1，1，2四氟乙烷（R134a）萃取技術(shù)，建立了魚(yú)肉中6種性激素殘留的氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）分析方法。樣品中的藥物經(jīng)過(guò)亞臨界R134a萃取后，先進(jìn)行冷凍過(guò)濾去脂，然后通過(guò)C18和NH2固相萃取小柱凈化，最后經(jīng)七氟丁酸酐衍生后，采用GCMS進(jìn)行定性與定量分析。本實(shí)驗(yàn)確定了亞臨界R134a萃取6種性激素的最佳條件為：萃取壓力4 MPa，萃取溫度30 ℃，夾帶劑用量6 mL。在此條件下，6種性激素在5-1000 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；檢出限為0.2-1 μg/kg （S/N=3）。在3種濃度添加水平（1， 5和10 μg/kg）下，6種激素的平均回收率為70.5%-103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 2.1%-12.5%。采用本方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，在一份羅非魚(yú)樣品中檢出己烯

1引言

性激素屬于同化激素，由于它具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，可以加快動(dòng)物生長(zhǎng)，為動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益，在20世紀(jì)曾被廣泛用于動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中^[1]。然而，部分性激素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，容易在動(dòng)物組織中形成蓄積和殘留，人類(lèi)如果長(zhǎng)期食用含有這些性激素的動(dòng)物組織，容易導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異常甚至誘發(fā)癌變^[2]。因此，歐盟自20世紀(jì)90年代已通過(guò)立法，限制或者禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用性激素^[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也發(fā)布了關(guān)于動(dòng)物飼料和飲用水中禁用藥物的176號(hào)公告^[4]，明確禁止己烯雌酚、雌二醇等性激素類(lèi)藥物的使用。但由于利益的驅(qū)使，目前仍然存在動(dòng)物飼料中非法添加明令禁止的性激素類(lèi)藥物的現(xiàn)象。所以，不斷加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源食品中性激素類(lèi)藥物的檢測(cè)和評(píng)價(jià)對(duì)保障動(dòng)物源食品的安全仍然具有重要意義。

目前，動(dòng)物源食品中性激素殘留檢測(cè)的樣品前處理方法主要有液液萃取法^[5，6]、超聲輔助萃取法^[7]、微波輔助萃取法^[8]、基質(zhì)分散固相萃取法（MSPD）^[9]、加速溶劑萃取法^[10]以及超臨界流體萃取法^[11]等。前3種方法幾乎都需要使用乙腈、甲醇、叔丁基甲醚等有機(jī)溶劑，存在操作復(fù)雜、耗時(shí)多、有機(jī)溶劑用量大、對(duì)操作人員有毒害風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。MSPD多用于蔬菜、水果中藥物殘留的前處理，在動(dòng)物源尤其是肉類(lèi)中的應(yīng)用較少。最后兩種方法中都需要配置專(zhuān)門(mén)的設(shè)備，投資較大，難以得到普遍推廣和應(yīng)用。1，1，1，2四氟乙烷（R134a）的破壞臭氧潛能值（ODP）為0，全球變暖系數(shù)值（GWP）為0.29，所以常作為一種新型環(huán)保的制冷劑使用。同時(shí)，R134a的介電常數(shù)（ε=9.5）和偶極距（DM=2.05）與二氯甲烷（ε=9.08， DM=1.55）十分接近，因此具有與二氯甲烷類(lèi)似的溶劑性質(zhì)，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且具有良好的安全性能（不易燃、不易爆、無(wú)毒、無(wú)腐蝕性）^[12]，所以目前已成為一種新型和綠色環(huán)保的萃取介質(zhì)，受到了越來(lái)越多的研究和重視^{[13，14]}。近幾年，利用亞臨界R134a萃取技術(shù)作為一種可替代超臨界CO2前處理技術(shù)的新型樣品前處理技術(shù)，已成功應(yīng)用于持久污染物和藥物殘留的檢測(cè)^[15-17]。與傳統(tǒng)的溶劑萃取法相比，亞臨界R134a萃取效率高，操作簡(jiǎn)便，能同時(shí)完成萃取和分離，大大縮短操作時(shí)間，而且不造成環(huán)境污染。與超臨界CO2萃取法相比，亞臨界R134a在低壓和接近常溫的條件下即可達(dá)到符合檢測(cè)要求的萃取效果，對(duì)設(shè)備要求低，操作條件溫和，更容易得到推廣和應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)利用亞臨界R134a萃取技術(shù)作為樣品的前處理技術(shù)， 并通過(guò)與氣相色譜質(zhì)譜的聯(lián)用，建立同時(shí)檢測(cè)魚(yú)肉中6種性激素殘留的新方法。本方法操作簡(jiǎn)單、溶劑用量少、選擇性好、靈敏度高，為水產(chǎn)品性激素檢測(cè)提供了一種高效可靠的檢測(cè)方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

亞臨界萃取裝置（自行設(shè)計(jì)，見(jiàn)圖1），68905973氣相色譜質(zhì)譜儀（GCMS，美國(guó)Agilent公司）， 漩渦混合器（上?？等A生化儀器制造廠）。

甲基睪酮、丙酸睪酮（純度>98%，Dr.Ehrenstorfer公司），雌三醇、醋酸甲羥孕酮、β雌二醇乙酸酯、己烯雌酚（純度>98%，Sigma公司）；甲醇、乙腈、丙酮（色譜純）；七氟丁酸酐（Regis）， C18、NH2固相萃取小柱（500 mg，6 mL，上海安譜科學(xué)儀器有限公司），SiO2（天津市紅巖化學(xué)試劑廠），玻璃纖維（成都市科龍化工試劑廠），R134a制冷劑儲(chǔ)罐（美西英力士公司）。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取各種激素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于

Symbolm@@ 18 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。根?jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.3亞臨界R134a萃取

稱(chēng)取絞碎后的魚(yú)肉組織樣品4.0 g，置于研缽中，加入12 g SiO2，充分研磨使魚(yú)肉均質(zhì)。然后加入4 g玻璃纖維，與樣品充分混合，使其分散均勻。用鑷子將混勻的樣品裝入萃取釜，加入適量的夾帶劑，然后在萃取釜的底端和頂端均加入少量脫脂棉，以防止樣品堵塞管道。將萃取釜裝入萃取裝置，在設(shè)定的條件下進(jìn)行亞臨界萃取。先靜態(tài)萃取20 min，然后動(dòng)態(tài)萃取40 min，流速為1 mL/min。用甲醇作為收集溶液，萃取結(jié)束后將收集液置于

Symbolm@@ 18 ℃冰箱中貯存。

2.4樣品純化

將收集液從冰箱中取出，迅速過(guò)0.22 μm微孔濾膜，可以去除析出的大量脂肪。將濾液在35 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用1 mL 乙腈溶解殘?jiān)⒓尤? mL水，作為上樣液。

取C18固相萃取小柱，預(yù)先分別用5 mL甲醇、5 mL水淋洗柱子，然后將上述上樣液以1 mL/min流速過(guò)柱。用5 mL 30%（V/V）甲醇水洗脫雜質(zhì)，真空抽干。將NH2小柱用5 mL甲醇活化，并串聯(lián)在C18小柱下，用2×3 mL甲醇洗脫，洗脫液用N2吹干。

2.5樣品衍生

在吹干后的殘?jiān)屑尤?00 μL丙酮、50 μL七氟丁酸酐，漩渦混勻30 s，在60 ℃條件下密閉衍生1 h，衍生后用N2 吹干，加入200 μL正己烷溶解，取1 μL進(jìn)行檢測(cè)。

第10期盧 杰等： 亞臨界1，1，1，2四氟乙烷萃取氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定魚(yú)肉中

6種性激素殘留

2.6色譜質(zhì)譜條件

HP5 MS石英毛細(xì)管柱（25 m×0.32 mm×0.52 μm）；載氣為高純氦氣，流速1.2 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫程序：初溫120 ℃，保持2 min，然后以15 ℃/min，升至250 ℃，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。離子源：EI源，電離能量70 eV； 離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：3 min；掃描質(zhì)量范圍：50-800 amu。

3結(jié)果與討論

3.1亞臨界R134a萃取條件的優(yōu)化

3.1.1萃取壓力對(duì)回收率的影響壓力是影響亞臨界R134a萃取效率的重要因素。在其它因素固定的情況下，考察了壓力（4， 8和12 MPa）對(duì)6種激素的回收率的影響。由圖2可知，隨著壓力的增加，6種激素的回收率均逐漸下降。分析原因可能是隨著壓力的增加，R134a的粘度增加，擴(kuò)散性能減弱，對(duì)基質(zhì)的滲透能力降低，從而使溶劑分子與目標(biāo)物的相互作用減弱；另一方面，隨著壓力的增加，R134a的物質(zhì)的量增加，相同條件下夾帶劑甲醇所占的比例降低，從而使整個(gè)二元體系（R134a甲醇）的極性降低，對(duì)目標(biāo)物的溶解能力下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇萃取壓力為4 MPa。

3.1.2萃取溫度對(duì)回收率的影響設(shè)定萃取壓力為4 MPa，添加夾帶劑甲醇6 mL，考察萃取溫度對(duì)6種激素回收率的影響。由圖3可知，在30 ℃時(shí)，6種激素的回收率均達(dá)到最大，隨著溫度升高，6種激素的回收率逐漸降低。溫度升高，溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)增加，這有利于目標(biāo)物在R134a中的溶解；但另一方面，在恒定的壓力條件下，隨著溫度升高，R134a的密度逐漸下降，從而對(duì)目標(biāo)物的溶解能力逐漸降低。并且，隨著萃取溫度升高，R134a的密度下降可能占主導(dǎo)作用，因此6種激素的回收率隨著溫度的升高而降低。本實(shí)驗(yàn)選擇萃取溫度為30 ℃。

3.1.3夾帶劑甲醇用量對(duì)回收率的影響夾帶劑可以顯著改善超/亞臨界流體的溶解性能，所以本實(shí)驗(yàn)在萃取壓力和溫度分別確定為4 MPa和30 ℃后，選定甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的夾帶劑，考察了甲醇用量對(duì)回收率的影響。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)不加夾帶劑時(shí)，6種激素的回收率均低于40%，達(dá)不到檢測(cè)的要求。隨著夾帶劑用量的增加，各種激素的回收率逐漸增大。當(dāng)夾帶劑用量為6 mL時(shí)，6種激素的回收率均能達(dá)到87%以上。在完全達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和要求的情況下，為了盡量減少有機(jī)溶劑的使用，本實(shí)驗(yàn)最終確定夾帶劑甲醇的用量為6 mL。

1. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）； 2. 甲基睪酮（Methyltestosterone）； 3. 雌三醇（Estrio）； 4. β雌二醇乙酸酯（βEstradiol acetate）； 5. 丙酸睪酮（Testosterone propionate）； 6. 醋酸甲羥孕酮（Medroxyprogesterone acetate）。[HT5][TS）]

3.2凈化方法的選擇

由于共萃物中有大量的脂類(lèi)雜質(zhì)容易堵塞固相萃取小柱，所以萃取液在上柱前必須經(jīng)過(guò)去脂步驟。有機(jī)溶劑去脂法容易造成目標(biāo)物的損失，而冷凍過(guò)濾是一種純物理方法，其原理主要是依據(jù)脂肪雜質(zhì)與目標(biāo)物在甲醇中溶解度的不同。在低溫下，脂肪會(huì)大量析出，而目標(biāo)物仍然溶解在甲醇中，從而通過(guò)過(guò)濾將目標(biāo)物與雜質(zhì)分開(kāi)。樣品溶液經(jīng)過(guò)冷凍過(guò)濾去脂后，用C18和NH2固相萃取小柱雙柱串聯(lián)對(duì)其進(jìn)行凈化。最終，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)達(dá)到良好的分離效果，滿足了檢測(cè)分析的要求。

3.3線性關(guān)系、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢出限

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為5-1000 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)物衍生產(chǎn)物定量離子的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度 x（μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種性激素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3倍的信噪比（S/N）計(jì)算各化合物的檢出限（LOD），6種性激素的LODs為0.2-1.0 μg/kg。各目標(biāo)物經(jīng)七氟丁酸酐衍生后，通過(guò)儀器分析衍生物的質(zhì)譜圖并結(jié)合文獻(xiàn)[18，19]， 確定各化合物的特征離子。6種激素的保留時(shí)間、特征離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及檢出限見(jiàn)表1。

Fig.5Chromatograms of 6 sex hormones standards （a） and practical sample （b）

1. 己烯雌酚（Diethylstilbestrol）； 2. 甲基睪酮（Methyltestosterone）； 3. 雌三醇（Estriol）； 4. β雌二醇乙酸酯（βEstradiol acetate）； 5. 丙酸睪酮（Testosterone propionate）； 6. 醋酸甲羥孕酮（Medroxyprogesterone acetate）。[HT5][TS）]

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