摘要[HTSS]利用凝集素分子對醣類有專一性吸附特性，對內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)中的多醣類成分進(jìn)行吸附，建立了凝集素去除膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素的吸附系統(tǒng)。二氧化硅玻璃經(jīng)酸蝕，再以胺基硅烷進(jìn)行胺化后，將凝集素嫁接其上。結(jié)果表明，1， 2和5 g/L的凝集素對于膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素吸附率皆大于99%；30顆嫁接凝集素玻璃球可去除8.4 mL膠原蛋白溶液（濃度為2 g/L）中內(nèi)毒素（去除率大于99%）。未來更可將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內(nèi)部，利用管柱分離法去除膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素，建立有效、操作簡單且成本低廉去膠原蛋白溶液內(nèi)毒素裝置。

1引言

隨著組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，許多組織修復(fù)生物性取代材料紛紛問世，并已成功應(yīng)用于皮膚、外圍神經(jīng)、牙周組織及齒槽骨等組織再生領(lǐng)域。其中，膠原蛋白是眾多取代材料中應(yīng)用最為廣泛，且最具潛力的生物材料。膠原蛋白應(yīng)用范圍涵蓋保健營養(yǎng)品、化妝品和高階醫(yī)藥等眾多產(chǎn)業(yè)，利用其生物兼容性、具生物可降解性、抗菌性與止血性等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)適當(dāng)后續(xù)處理后，可控制其在體內(nèi)分解速率并可加工成不同的應(yīng)用型態(tài)^[1]。 此外，膠原蛋白還可依據(jù)臨床應(yīng)用的需求，制成薄膜、海綿狀、粉末或纖維織品等多種形態(tài)， 作為止血、整型外科及燒燙傷敷料等臨床應(yīng)用。然而，市面上販賣的膠原蛋白多受到內(nèi)毒素存在的困擾，許多以膠原蛋白為原料的醫(yī)用產(chǎn)品，常會(huì)因?yàn)槠鋬?nèi)毒素含量過高，造成材料與生物體接觸或植入后產(chǎn)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)而限制其應(yīng)用。因此，尋求有效去除內(nèi)毒素方法，對于發(fā)展膠原蛋白材料在醫(yī)用產(chǎn)品方面的應(yīng)用極其重要。

內(nèi)毒素為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的一部份，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜內(nèi)層為磷酯層，內(nèi)毒素則是存在于外膜。內(nèi)毒素為具有疏水性脂多醣體（Lipopolysaccharide，LPS）的小分子，分子量約為10 kDa。生物體毒性反應(yīng)主要來自脂質(zhì)部分（Lipid A）。當(dāng)內(nèi)毒素（脂多醣體分子）進(jìn)入動(dòng)物體血液或身體組織中時(shí)，脂多醣體會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的各種免疫反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)燒、白血球數(shù)目改變、彌漫性血管內(nèi)凝血反應(yīng)、低血壓、休克，甚至死亡等非特異性的生理病理反應(yīng)。即使少量的內(nèi)毒素也會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)的哺乳動(dòng)物死亡^[2，3]。

內(nèi)毒素為高度熱穩(wěn)定性分子，煮沸30 min仍無法破壞其穩(wěn)定性，超氧化物、過氧化物和次氯酸鹽（漂白水）等強(qiáng)氧化劑可將其分解。由于內(nèi)毒素具高度熱穩(wěn)定性，同時(shí)亦具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，因此須使用強(qiáng)氧化劑才可將其分解；然而膠原蛋白不論是在高溫處理或是強(qiáng)氧化劑的反應(yīng)后，皆會(huì)產(chǎn)生變性現(xiàn)象，因此膠原蛋白并不適用此類方法去除所含內(nèi)毒素。目前，去除膠原蛋白中內(nèi)毒素的方法為：在膠原蛋白萃取純化過程中采取全程無菌操作及嚴(yán)密的無菌控管，以制備出無內(nèi)毒素的膠原蛋白；另可在膠原蛋白萃取后以不同分子量過濾膜過濾內(nèi)毒素與膠原蛋白；或以離子交換法去除膠原蛋白中的內(nèi)毒素^[4-6]。上述方法均能將內(nèi)毒素從膠原蛋白溶液中移除，但實(shí)驗(yàn)成本相當(dāng)高，使得低/無內(nèi)毒素的膠原蛋白價(jià)格居高不下，限制膠原蛋白的發(fā)展及應(yīng)用。此外，有研究利用脂多醣體分子中的Lipid A基團(tuán)， 以脂質(zhì)吸附進(jìn)行包覆以形成微胞，進(jìn)而將內(nèi)毒素移除^[7，8]，但此分離方法不適用于去除內(nèi)毒素膠原蛋白材料的大量生產(chǎn)。

本研究利用凝集素分子對于醣類分子專一吸附特性，對內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)中的多醣類成分進(jìn)行吸附，以除去膠原蛋白溶液中所含內(nèi)毒素。凝集素是一種對醣類具有高度特異性的醣類接合蛋白^[9，10]。在免疫技術(shù)中常利用凝集素辨識細(xì)胞膜上特定醣蛋白結(jié)構(gòu)。凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，因此常作為研究細(xì)胞膜上特定醣基的探針，或是應(yīng)用于分離純化具有重要生物功能的醣類。不同凝集素對特定醣基具有專一性的結(jié)合能力，如小麥凝集素對N乙酰葡萄糖胺有特異性結(jié)合能力，在內(nèi)毒素脂多醣體分子中含有N乙酰葡萄胺，因此或可利用凝集素進(jìn)行N乙酰葡萄胺吸附以除去內(nèi)毒素。本研究最終目標(biāo)是以凝集素去除膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素，并進(jìn)一步將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內(nèi)部，利用管柱分離法去除膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素，建立有效、操作簡單且成本低廉去膠原蛋白溶液內(nèi)毒素裝置，從而大幅降低低/無內(nèi)毒素膠原蛋白制造成本，提升膠原蛋白產(chǎn)品整體應(yīng)用的成效。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1膠原蛋白萃取與純化

于4 ℃，將牛皮除毛，以0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，將牛皮剪成約0.5 cm×0.5 cm的碎片；以0.15 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris緩沖液 （pH 7.4）清洗后，將其置入0.5 mol/L醋酸溶液中，以均質(zhì)攪拌機(jī)打碎，使膠原蛋白從牛皮組織中溶解出來；加入0.5 g/L胃蛋白酶作用16-24 h后，高速離心溶有膠原蛋白的醋酸溶液，收集上清液；加入2.5 mol/L NaCl于上清液中進(jìn)行鹽析，待靜置16-24 h后，再進(jìn)行高速離心，收集沉淀膠原蛋白；將膠原蛋白沉淀物以50 mmol/L Tris 緩沖液透析，去除鹽分，將其溶于含1 mol/L NaCl、50 mmol/L Tris緩沖液中，靜置16-24 h后進(jìn)行高速離心，收集上清液；加入1.8 mol/L NaCl于上清溶液中，以均質(zhì)機(jī)攪拌均勻后靜置16-24 h，高速離心后收集上清液；純化后膠原蛋白醋酸溶液中于

Symbolm@@ 20 ℃低溫下保存，待使用時(shí)以pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液于4 ℃下透析至中性。

2.2玻璃球凝集素吸附劑設(shè)計(jì)與制備

采用小麥凝集素作為去除內(nèi)毒素吸附劑，先以H2SO4H2O2（3∶1，V/V）蝕刻玻璃球（直徑0.5 cm） 4 h，先使玻璃球表面產(chǎn)生氫氧基，接著加入以胺基硅烷第10期黃忠發(fā)等： 利用凝集素修飾的二氧化硅玻璃球去除膠原蛋白中的內(nèi)毒素

2.3內(nèi)毒素移除分析

內(nèi)毒素移除測試分析先采用類似內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)多醣體醣蛋白作為測試樣品。內(nèi)毒素含量檢測則使用內(nèi)毒素含量檢測試劑CAPE COD， （Kit no：XP0202，USA）。內(nèi)毒素濃度測定采用LAL（Limulus amebocyte lysate）凝膠終點(diǎn)呈色法。LAL試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)形成黃色的凝膠，于酶聯(lián)免疫吸附分析儀（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA reader）[TS（]圖1第一型膠原蛋白電泳圖

Fig.1SDSPAGE of purified type I collagen[HT5][TS）]波長405 nm下測得吸光值，再與標(biāo)準(zhǔn)溶液所測吸光值比較后，即可測得內(nèi)毒素含量濃度。在不同的凝集素濃度、膠原蛋白溶液及溫度條件下，測試玻璃球凝集素吸附劑移除內(nèi)毒素效能。

3結(jié)果與討論

3.1膠原蛋白萃取純化

第一型膠原蛋白的分子量約為283 kDa，由兩條含有1056個(gè)胺基酸的α1，以及一條含有1029個(gè)胺基酸的α2組合而成。SDSPAGE電泳實(shí)驗(yàn)（圖1）表明，本研究萃取純化的膠原蛋白產(chǎn)物具有較高的純度。

3.2玻璃球凝集素吸附劑表面元素分析

[TS（]圖3表面元素分析結(jié)果（A）未處理玻璃球表面；（B）經(jīng)酸蝕后玻璃球表面；（C）經(jīng)胺基硅烷胺化后玻璃球表面及（D）嫁接凝集素玻璃球表面

Fig.3ESCA analyses of （A） untreated silica bead， （B） acid etched silica bead， （C）aminated silica bead and （D） lectingrafted silica bead[HT5][TS）]

3.3凝集素濃度對內(nèi)毒素吸附的影響

以玻璃板為進(jìn)行測試（表1），利用不同濃度凝集素（1， 2和5 g/L）與胺化后玻璃板表面反應(yīng)，所制

成玻璃板凝集素吸附劑均能有效吸附膠原蛋白溶液（濃度為0.5g/L）內(nèi)所含內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量由2.14×105 EU降低至10

Symbolm@@ 2-10

Symbolm@@ 3 EU間，其內(nèi)毒素吸附率可達(dá) 99%。考慮制造成本，在后續(xù)的凝集素嫁接改質(zhì)上均采用濃度為1 g/L凝集素進(jìn)行制備。

3.4玻璃球凝集素吸附劑吸附內(nèi)毒素測試

為測試玻璃球凝集素吸附劑吸附內(nèi)毒素效率，利用2 g/L膠原蛋白溶液進(jìn)行不同玻璃球顆數(shù)（提供不同吸附表面積）及不同體積膠原蛋白溶液內(nèi)毒素吸附測試（表2）。結(jié)果表明，未經(jīng)吸附處理膠原蛋白溶液內(nèi)所含內(nèi)毒素濃度為 2.34×108 EU，當(dāng)玻璃球數(shù)目固定在30顆玻璃球時(shí)，嫁接在其上的凝集素能吸附8.4 mL膠原蛋白溶液中內(nèi)毒素，其內(nèi)毒素可降低至2.80×10

Symbolm@@ 3 EU。但當(dāng)膠原蛋白溶液體積再增加時(shí)，其內(nèi)毒素吸附效果卻急劇下降，表明所嫁接凝集素均已吸附上內(nèi)毒素。當(dāng)膠原蛋白溶液體積固定在6 mL時(shí)，可發(fā)現(xiàn)70顆玻璃球吸附后，內(nèi)毒素濃度為3.06×10

Symbolm@@ 5 EU，因其可提供較多大的接觸面積，所以吸附效果提升。

由于不同濃度膠原蛋白溶液其內(nèi)毒素含量均會(huì)不同，且膠原蛋白溶液黏度亦隨濃度增加而增加，此黏度的增加會(huì)影響膠原蛋白溶液內(nèi)內(nèi)毒素與凝集素接觸的機(jī)會(huì)而降低吸附效率。對1 mL的5和6 g/L膠原蛋白溶液進(jìn)行內(nèi)毒素吸附前后比較（表3）。嫁接上凝集素玻璃球雖能降低濃度6 g/L膠原蛋白溶液內(nèi)毒素含量，由3.01×109 EU減少至2.39×105 EU，但其內(nèi)毒素含量很高，顯示在高濃度膠原蛋白溶液內(nèi)毒素去除上仍有限制。

通常，膠原蛋白在萃取純化過程中均需于4 ℃的低溫環(huán)境下進(jìn)行，若環(huán)境溫度超過4 ℃時(shí)，所萃取純化后膠原蛋白便會(huì)開始重組產(chǎn)生纖維的型態(tài)。本研究在不同環(huán)境溫度下測試了凝集素吸附內(nèi)毒素效率。在此實(shí)驗(yàn)中是以類似內(nèi)毒素成份多醣體的醣蛋白作為測試樣品，凝集素在室溫25 ℃及 4 ℃的低溫環(huán)境下也具有極佳內(nèi)毒素吸附效果，顯示凝集素內(nèi)毒素吸附效果較不受溫度的影響。

4結(jié)論

膠原蛋白的純化及保存不易，限制了膠原蛋白于臨床上的應(yīng)用。在膠原蛋白萃取并純化過程及內(nèi)毒素含量測定后，進(jìn)一步研究出簡單、方便、易操作的去除內(nèi)毒素方法，以有效縮短低內(nèi)毒素膠原蛋白產(chǎn)品的成本，期望能發(fā)展出低內(nèi)毒素的膠原蛋白材料。

本研究利用二氧化硅玻璃球?yàn)槲絻?nèi)毒素載體，通過酸蝕令其表面形成OH基團(tuán)，并以胺基硅烷進(jìn)行胺化，令其表面產(chǎn)生具反應(yīng)性胺基。其后利用EDC活化凝集素羧基，并利用NHS穩(wěn)定活化區(qū)，最后再將凝集素與反應(yīng)性胺基二氧化硅玻璃球載體作用，即可將凝集素固定于其上。采用ESCA進(jìn)行表面元素分析，亦可確定凝集素成功嫁接于二氧化硅玻璃球載體上。探討不同凝集素及膠原蛋白濃度對于內(nèi)毒素吸附效率影響，利用不同濃度凝集素（1.0， 2.0和5.0 g/L）與胺化后二氧化硅玻片表面反應(yīng)，各組均能有效吸附膠原蛋白溶液內(nèi)所含內(nèi)毒素（達(dá)99%以上內(nèi)毒素吸附率），顯現(xiàn)凝集素對于內(nèi)毒素吸附效率甚佳，僅需低濃度凝集素即可得高吸附效率；而膠原蛋白溶液黏度隨濃度增加而遞增，該粘度變化會(huì)影響膠原蛋白溶液內(nèi)內(nèi)毒素與凝集素接觸的機(jī)會(huì)而降低吸附效率。嫁接于三維立體玻璃球載體凝集素因其可提供較多接觸面積，故隨著膠原蛋白體積量增加，仍可維持高吸附效率，顯示立體圓球型態(tài)由于其球體間接觸面積與碰撞機(jī)率增加，對于其上凝集素吸附內(nèi)毒素效能有顯著裨益。未來可更進(jìn)一步利用管柱分離操作原理，將嫁接凝集素玻璃球填充于管柱內(nèi)部，設(shè)計(jì)一針對膠原蛋白中內(nèi)毒素特異蛋白質(zhì)醣類進(jìn)行吸附系統(tǒng)，建立有效、操作簡單且低成本的去膠原蛋白溶液內(nèi)毒素裝置，進(jìn)而提升膠原蛋白產(chǎn)品整體應(yīng)用的成效。

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