摘要[HTSS]建立了光電化學(xué)系統(tǒng)競爭性檢測生物素（Biotin）小分子濃度的方法。采用聯(lián)吡啶釕[Tris（2，2′bipyridine）ruthenium， Rubpy）]作為標記物，以氧化錫納米顆粒為電極，草酸鹽為電子供體還原標記物。在470 nm光激發(fā)下，聯(lián)吡啶釕的外層電子吸收能量后由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，注入半導(dǎo)體氧化錫納米顆粒電極的導(dǎo)帶，形成光電流信號；草酸鹽還原失去電子的聯(lián)吡啶釕使其恢復(fù)初始狀態(tài)，從而可以再次作為電子供體受激發(fā)產(chǎn)生光電流信號。在競爭性檢測生物素（Biotin）濃度時，親和素（Avidin）吸附到氧化錫納米顆粒電極表面作為識別元件，在濃度大于0.5 g/L時能夠達到最大的電極表面覆蓋率。1 μmol/L Rubpybiotin與不同濃度Biotin組成的混合溶液與電極表面的Avidin發(fā)生親和反應(yīng)，光激發(fā)后檢測光電流大?。划斎芤褐蠦iotin的濃度增加時，致使與電極表面Avidin結(jié)合的Rubpybiotin量減少，在光照射下光電流信號降低。這一競爭性光電檢測方法檢測Biotin時，檢出限為8 μg/L。本方法可進一步擴展，應(yīng)用于有機化合物的競爭性免疫檢測。

1引言

小分子普遍存在于人類生命活動以及所處的環(huán)境中。環(huán)境中多種持久性有機污染物也是有機小分子化合物，如多環(huán)芳香烴、氯代二苯并二惡英、多氯二苯并呋喃以及多氯聯(lián)苯等。在諸多常用的檢測小分子化合物的分析方法中，基于抗體識別的免疫檢測方法在速度、通量和成本方面具有顯著的優(yōu)勢。免疫檢測小分子時，通常會采用競爭性檢測的方式，即將待檢測物標記后與其抗體結(jié)合產(chǎn)生可檢測的信號；當加入未標記的待檢測物時，與標記的待檢測物競爭有限的抗體結(jié)合位點，導(dǎo)致信號下降^[1]。目前多種標記物和相關(guān)的檢測方法與儀器已被開發(fā)應(yīng)用，如放射性同位素、熒光染料、酶、氧化還原分子等。

目前量子產(chǎn)率最高的光電化學(xué)電池采用納米TiO2顆粒膜組裝在導(dǎo)電玻璃上，并利用表面吸附的釕吡啶化合物使之敏化^[2]，Kalyanasundaram等^[3]對其它寬帶隙半導(dǎo)體電極和敏化劑也進行了研究。使用敏化劑作為標記分子可以進行生物分子親和反應(yīng)的檢測，并且光電化學(xué)檢測方法理論上應(yīng)該具有很高的靈敏度；因為在這種方法的激發(fā)信號（光）和檢測信號（電流）不會產(chǎn)生相互干擾^[4]。利用Cd量子點（Quantum Dots）^[5] 和納米管^[6，7]進行光電化學(xué)傳感已有報道；Pandey等^[8]利用DNA嵌入染料蒽醌作為指示劑光電化學(xué)檢測溶液中的DNA，該方法中光激發(fā)的蒽醌在溶液中被電子供體還原，利用修飾的石墨碳原子電極可以檢測氧化還原電位的變化。利用蒽醌的光電化學(xué)性質(zhì)也可研究固定于金電極上的雙鏈DNA的電荷傳輸性質(zhì)，并可以用于疾病的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型^[9]。

半導(dǎo)體納米顆粒電極較其它電極在光電化學(xué)檢測中具有明顯優(yōu)勢，可以顯著提高檢測靈敏度，本研究組在檢測溶液中的DNA研究中已經(jīng)證明^[10]。除利用半導(dǎo)體納米顆粒電極檢測DNA^[11，12]外，還可利用納米顆粒電極非標記檢測了多巴胺（Dopamine）^[13]和ATP^[14]的濃度。關(guān)于光電化學(xué)檢測生物結(jié)合反應(yīng)已有報道，尤其值得注意的是抗體/抗原的結(jié)合反應(yīng)的光電化學(xué)檢測^[15，16]。

聯(lián)吡啶釕作為標記物已廣泛用于電化學(xué)發(fā)光檢測免疫反應(yīng)^{[17，18]}，可利用聯(lián)吡啶釕合吩嗪（Ru（bpy）2dppz， dppz=dipyrido[3，2a：2′，3′c]phenazine）與dsDNA具有高親和性（K=106-107 L/mol）^[19]的特點檢測金電極表面固定的雙鏈DNA^{[20，21]}。Zhang 等^[14]采用納米顆粒電極和Ru（bpy）2dppz 檢測了癌細胞中ATP的濃度。

本研究組曾采用染料敏化的光電化學(xué)系統(tǒng)定量檢測溶液中的DNA^[10]，該檢測系統(tǒng)包括光電化學(xué)標記物Ru（bpy）2dppz，電子供體草酸鹽和電極材料氧化錫納米顆粒。由于該分析系統(tǒng)具有許多高量子產(chǎn)率光電化學(xué)太陽能電池的優(yōu)點，所以在檢測溶液中的DNA時，靈敏度比導(dǎo)體電極、金電極和碳電極有顯著改善。本研究采用光電化學(xué)方法競爭性檢測Biotin，Rubpybiotin復(fù)合物在此競爭性檢測中作為光電化學(xué)標記分子；當各種濃度的Biotin（待檢測物）與1 μmol/L Rubpybiotin混合溶液與電極表面的Avidin反應(yīng)后，標記分子受激發(fā)所產(chǎn)生的光電流會隨Biotin濃度的增加而減小。本方法對Biotin的檢出限為8 μg/L。本研究為采用光電化學(xué)方法競爭性檢測小分子的濃度提供了參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

雙（聯(lián)吡啶）4′甲基4羰基吡啶釕N琥珀酰亞胺酯雙六氟磷酸酯（Ruthenium bis（2，2′bipyridine）（4methyl4′carboxyl2，2′bi pyridine） NHS ester（RuNHS），美國Fluka公司）；Avidin和Biotin（美國Sigma公司）；Succinimidyl 6（biotinamido）hexanoate（biotinLCNHS，美國Pierce公司）。WLTNSI090銦錫氧化物鍍膜玻璃（涂層（96±4） nm，片電阻（18±2） Ω）， 深圳偉光股份有限公司）。

2.2實驗步驟

2.2.1Rubpy標記avidin和biotinRubpy標記Avidin按文獻[22]方法進行。Rubpybiotin（圖1）的合成：向溶于二甲基甲酰胺（Dimethylformamide， DMF）的RuNHS中加入10倍過量的乙二胺，冰浴中反應(yīng)1 h；在減壓情況下，去除未反應(yīng)的乙二胺和DMF；將所得固體溶解在丙酮中，加入乙醚沉淀；沉淀所得固體和biotinLCNHS以摩爾比2∶1溶解在DMF中，室溫反應(yīng)3 h，Sephadex G25柱分離產(chǎn)物。產(chǎn)物通過NMR， UVVis吸收和循環(huán)伏安法表征。[TS（]圖1Rubpybiotin復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

Fig.1Structure of tris（2，2′bipyridine）ruthenium （Rubpy）biotin conjugate[HT5][TS）]

2.2.2Biotin和Avidin的結(jié)合反應(yīng)氧化錫電極按文獻[22]方法制備。氧化錫電極吸附Avidin 的方法是以25 μL Avidin蛋白溶液覆蓋0.5 cm2 電極表面，靜置30 min；以20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 7.2）沖洗后，用1%牛血清白蛋白封閉電極，以減少非特異性結(jié)合。進行Biotin和Avidin之間的結(jié)合反應(yīng)時，將25 μL Biotin或Rubpybiotin混合液覆蓋在Avidin吸附的電極上，并在無外力混合情況下室溫反應(yīng)1 h；沖洗后，在電解液中測定光電流。

2.2.3光電流測定光電流測定用CHI800型電化學(xué)分析儀，Pt作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極，電極間所加偏壓為+0.3 V；激發(fā)光源來自藍色發(fā)光二極管（深圳Lamp公司），照明面積為0.2 cm2。在進行光譜測量時， 500 W的氙燈和光柵用于產(chǎn)生單色可變波長的光， 用于激發(fā)。

3結(jié)果與討論

3.1檢測條件的優(yōu)化

本研究以Biotin/Avidin為模式系統(tǒng)，研究光電化學(xué)方法檢測小分子的可行性。Biotin是一種水溶性維生素（244 Da）。Avidin是蛋清中存在的糖蛋白（66 kDa）。Avidin和Biotin的親和性非常高，解離常數(shù)為1015 mol/L。Avidinbiotin系統(tǒng)已被廣泛用于免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附分析以及分子生物學(xué)測定。本實驗將Avidin固定在氧化錫電極表面，使之捕獲溶液中的Biotin或Rubiotin，通過測量Ru標記物產(chǎn)生的光電流測量溶液中Biotin的濃度（圖2）。

Avidin含有堿性氨基酸如賴氨酸和精氨酸，等電點約為10，易于吸附到帶負電荷的電極表面。實驗表明，Avidin對氧化錫電極的吸附性很強，所以采用吸附法在電極上固定Avidin。將電極在各種濃度的AvidinRu中浸泡2 h，沖洗后，通過測量光電流評估蛋白吸附效果。由圖3可見，當AvidinRu濃度從0增加至1 g/L時，光電流先隨溶液中AvidinRu濃度增加而增大；AvidinRu濃度大于0.5 g/L時，光電流達到平臺期，證明在這種濃度下蛋白吸附趨于飽和。表面固定的AvidinRu保持相對穩(wěn)定，[TS（]圖3吸附在氧化錫電極上的AvidinRu產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)光電流與AvidinRu濃度之間的關(guān)系， 小圖：AvidinRu吸附的氧化錫電極浸泡在Ph 7.5，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中（a）0 h（b）2 h后的光電流

Fig.3Steadystate photocurrent of Rulabeled avidin adsorbed on SnO2 electrode as a function of the protein concentration. Inset： Photocurrent of Rulabeled avidin coated SnO2 electrode after soaking in 20 mmol/L phosphate buffer， pH 7.5 for （a） 0 h （b） 2 h

光電流測定采用pH 5.5，10 mmol/L草酸鈉/100 mmol/L磷酸鈉溶液，以470 nm光激發(fā)。

為了平衡光電信號和靈敏度的要求，標記物劑濃度選擇1 μmol/L用于競爭性檢測。對照實驗采用吸附牛血清白蛋白（BSA）的電極與1 μmol/L Rubpybiotin反應(yīng)。它的光電流僅為吸附Avidin電極的1/3，并和未與Rubpybiotin的BSA電極產(chǎn)生的光電流相同，對比證明吸附Avidin電極產(chǎn)生的光電流響應(yīng)是由于Avidin和Botin之間的特異性相互作用。電極吸附Avidin反應(yīng)的Rubpybiotin受激發(fā)產(chǎn)生光電流時，光電流隨激發(fā)光波長的變化情況見圖5。光電流的譜形類似自由標記分子（插圖）的吸收光譜，在470 nm處達到峰值。Avidin/氧化錫電極本身并未表現(xiàn)出波長依存性，證明光激發(fā)所產(chǎn)生的光電流是由金屬Ru絡(luò)合物引起的。

3.2檢測溶液中biotin的濃度

確定了標記物Rubpybiotin的濃度后，在吸附了avidin的氧化錫電極上競爭性檢測Biotin濃度。檢測時，各種濃度的Biotin與1 μmol/L Rubpybiotin混合，并與吸附了Avidin的本研究組曾采用相同的光電化學(xué)檢測系統(tǒng)定量檢測了溶液中DNA的濃度^[10]。在本實驗中。利用標記物競爭性檢測Biotin濃度，檢出為8 μg/L，可與一些酶標記的電化學(xué)免疫測定方法相媲美。優(yōu)化檢測系統(tǒng)和反應(yīng)條件，如氧化錫薄膜結(jié)構(gòu)、固定方法以及借助外力使溶液混合均勻，還有可能提高檢測靈敏度。本方法可推廣應(yīng)用到以抗體或受體作為識別元件檢測其它小分子。聯(lián)吡啶釕和相關(guān)的聯(lián)吡啶類化合物的配基可以由多種官能團衍生而來，如羧基和氨基，用于小分子的共價修飾^[18]。與多數(shù)免疫分析中的酶標不同，金屬復(fù)合物標記體積小且較穩(wěn)定，適合于苛刻條件下的檢測。

盡管在本研究中以Biotin/avidin模仿競爭性免疫檢測反應(yīng)，其實在日常生活中僅測定Biotin濃度也是實際需要的。Biotin幾乎存在于所有活細胞中，缺乏會導(dǎo)致多種人類疾病。許多定量測定Biotin的分析方法已被開發(fā)應(yīng)用，包括分光光度法、色譜法及Avidin結(jié)合測定法^[23]，而且最近一些Biotin金屬的復(fù)合物在Avidinbiotin結(jié)合反應(yīng)的研究中已被合成， 并作為靈敏的熒光指示劑使用^[24]； 大多數(shù)測試方法的檢出限為ng或10

Symbolm@@ 7 mol/L^[23]，本方法的靈敏度與這些方法具有可比性。另外，本研究的Biotin/avidin競爭檢測方法可以認為是免疫競爭檢測的模型，只要能夠合成Rubpy標記的小分子和相應(yīng)的抗體，就能采用相同的方式實現(xiàn)小分子的光電化學(xué)免疫競爭檢測。

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