摘要[HTSS]采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法作為對(duì)照，利用顯微紅外光譜技術(shù)（4000-400 cm

Symbolm@@ 1）并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，研究了在55 ℃水浴中熱激處理不同時(shí)間（0， 2， 4， 6和8 min）對(duì)副溶血弧菌失活和亞致死損傷的作用效果。二維主成分分析（PCA）表明，正常細(xì)菌與受損細(xì)菌能夠各自聚類(lèi)，明顯區(qū)分，而且損傷程度不同的細(xì)菌也能夠基本區(qū)分。載荷圖分析（LPA）發(fā)現(xiàn)，加熱處理后，副溶血弧菌中的多糖、結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)、核酸都發(fā)生了變化，其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和DNA皆遭受損傷。類(lèi)模擬軟獨(dú)立建模（SIMCA）的結(jié)果表明，一般情況下，受不同程度熱損傷的細(xì)菌均有80%以上的預(yù)測(cè)率，能夠被有效區(qū)別開(kāi)。研究表明，顯微紅外光譜技術(shù)具有檢測(cè)熱激后亞致死損傷的副溶血弧菌的潛力。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞[HTSS]顯微紅外光譜技術(shù)；副溶血弧菌；亞致死；熱激

[HK][FQ（32，X，DY-W][CD15]20121207收稿；20130201接受

本文系國(guó)家863項(xiàng)目（No. 2012AA101601）、國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2012BAD29B02）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31000063）和上海市科委長(zhǎng)三角科技聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（No. 11495810600）聯(lián)合資助

* Email： xmshi@sjtu.edu.cn

1引言

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水產(chǎn)品中引起食物中毒的重要病原菌之一^[1]，在海產(chǎn)品中的攜帶率高達(dá)45.7%，在我國(guó)部分沿海地區(qū)，由副溶血弧菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒事件中居首位^[2]。副溶血弧菌對(duì)熱較敏感，一般在56 ℃處理5 -10 min即可被殺死。經(jīng)加熱、冷凍、脫水等處理后，細(xì)菌或被殺死，或無(wú)損存活下來(lái)，還有一些可能受到了亞致死性損傷^[3]。在適當(dāng)條件下，受損細(xì)菌可以修復(fù)損傷并恢復(fù)包括毒力和繁殖能力在內(nèi)的所有生理活性，仍然具有致病性，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。因此，檢測(cè)亞致死損傷的副溶血弧菌對(duì)于食品安全監(jiān)控具有重要意義。然而，用傳統(tǒng)的平板方法檢測(cè)受損細(xì)菌工作量大，檢測(cè)周期長(zhǎng)^[4]，往往需耗費(fèi)3-5 d或更長(zhǎng)的時(shí)間。

紅外光譜技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用興起于20世紀(jì)90年代，具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、成本低、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。紅外光譜能夠提供整個(gè)有機(jī)體的指紋圖譜，反映細(xì)胞的生化組成。紅外光譜技術(shù)在微生物分類(lèi)與鑒定、生物膜的研究、抗生素的研究等方面都得到廣泛應(yīng)用^[5]。2004年，Lin等將其應(yīng)用于細(xì)菌亞致死損傷的檢測(cè)^[6，7]。然而，目前大多文獻(xiàn)都采用普通紅外技術(shù)，尚未見(jiàn)利用紅外光譜技術(shù)研究副溶血弧菌亞致死損傷的報(bào)道。

本研究采用顯微紅外光譜技術(shù)研究副溶血弧菌的亞致死損傷，其靈敏度更高，制樣更簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間更短。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，采用主成分分析（PCA）鑒別區(qū)分不同程度損傷的細(xì)菌，并用類(lèi)模擬軟獨(dú)立建模（SIMCA）驗(yàn)證PCA模型的有效性；同時(shí)，采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行驗(yàn)證；用LPA找出細(xì)菌受損后發(fā)生改變的組成和結(jié)構(gòu)，探討細(xì)菌受損機(jī)制。本研究建立了快速有效的檢測(cè)亞致死損傷副溶血弧菌的方法，同時(shí)探討了食品加工過(guò)程中細(xì)菌細(xì)胞化學(xué)組成的變化和細(xì)菌滅活的機(jī)制，為改進(jìn)現(xiàn)有的殺菌方法和技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

Nicolet iN10 MX顯微紅外光譜儀（ThermoFisher，USA，帶液氮冷卻的MCT檢測(cè)器）。

非選擇性培養(yǎng)基：含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、含3% NaCl的胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）；選擇性培養(yǎng)基：硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽汁鹽蔗糖（TCBS）瓊脂；生理鹽水（0.9% NaCl）；最大修復(fù)稀釋液（0.1% 蛋白胨水）。

2.2供試菌株與熱處理培養(yǎng)液的制備

副溶血弧菌ATCC 17802（中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心）保存于

Symbolm@@ 80 ℃冰箱中，用40 mL胰蛋白胨大豆肉湯活化，37 ℃ 下175 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期；再將少量菌液涂布于TCBS平板，37 ℃ 培養(yǎng)16 h；挑取單菌落，接種于200 mL 胰蛋白胨大豆肉湯中，37 ℃ 下175 r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。各取10 mL 菌液分別加入15個(gè)50 mL 離心管中，4000 r/min 離心4 min 收集菌體。為消除代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌紅外譜圖的影響，將細(xì)胞用10 mL 無(wú)菌生理鹽水重復(fù)洗滌兩次后，重新懸浮于5 mL 生理鹽水中，制得熱處理培養(yǎng)液。

2.3熱激實(shí)驗(yàn)

將1個(gè)熱處理培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，另外4個(gè)裝有5 mL 熱處理培養(yǎng)液的離心管同時(shí)浸入55 ℃水浴，彼此保有一定空間以利于熱傳導(dǎo)，分別于2， 4， 6和8 min 后取出，并立即置于冰浴上冷卻至少5 min。每個(gè)熱激處理重復(fù)3次。在不同培養(yǎng)基上測(cè)定存活率，在1 h 內(nèi)完成活細(xì)胞的測(cè)定。

2.4損傷細(xì)胞在不同培養(yǎng)基上存活率的測(cè)定

取0.1 mL 熱激后的菌液加入0.9 mL 的0.1% 蛋白胨水中，經(jīng)10倍梯度稀釋后，各取10 μL 涂布于TSB和TCBS平板上；涂布后的平板在37 ℃下培養(yǎng)，8 h后開(kāi)始陸續(xù)對(duì)各培養(yǎng)基上的菌落形成單位（CFU）進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)平板計(jì)數(shù)皆做3次平行，每個(gè)熱激處理亦重復(fù)3次，計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)共9個(gè)結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。并以logCFU為縱坐標(biāo)，加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)菌存活曲線。

2.5光譜分析

熱激后的菌液同時(shí)進(jìn)行紅外測(cè)定。將4.9 mL剩余的菌液離心，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮于50 μL 生理鹽水中。取10 μL 菌液滴在BaF2片上，在干燥器中放置約0.5 h，待水分蒸干后，上機(jī)測(cè)試。顯微鏡放大倍數(shù)為150倍；空白BaF2片作背景；掃描范圍：4000-600 cm

Symbolm@@ 1；采集時(shí)間：3 s，即16張干涉圖加和；分辨率：8 cm

Symbolm@@ 1；通過(guò)面掃描（Map View）模式，每個(gè)樣品采集8張圖譜，步長(zhǎng)為100 μm×100 μm， 光闌為100 μm×100 μm。每個(gè)處理共有24張圖譜。

2.6數(shù)據(jù)處理與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

用OMNIC Picta軟件（Thermo Fisher， USA）將原始map文件轉(zhuǎn)換成8張紅外譜圖，再用OMNIC 8.2軟件（Thermo Fisher， USA）進(jìn)行預(yù)處理：選取4000-800 cm

Symbolm@@ 1譜圖進(jìn)行大氣背景抑制、自動(dòng)基線校正、歸一化（使酰胺譜帶Ⅰ的吸收強(qiáng)度皆等于1）等處理。因靈敏度較高，無(wú)需進(jìn)行平滑操作。再采用SavitzkyGolay 模式（7Point， polynomial degree 3）將譜圖轉(zhuǎn)換成二階導(dǎo)數(shù)譜圖。紅外譜圖提供的信息較復(fù)雜，一般需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。二階導(dǎo)數(shù)譜圖分別用SIMCAP 11.5軟件包（Umetrics， Ume， Sweden）進(jìn)行主成分分析（PCA）和載荷圖分析（LPA），用MATLAB 7.12.0軟件包（The Math Works， Inc.， USA）進(jìn)行類(lèi)模擬軟獨(dú)立建模（SIMCA）。

PCA是一種無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法，其目的就是將多維數(shù)據(jù)壓縮成幾個(gè)主要、獨(dú)立的潛在變量， 即主成分（PC），以消除眾多信息中相互重疊的部分，這些主成分保存了最相關(guān)和最具代表性的信息；PCA的得分圖可以方便地對(duì)不同類(lèi)別進(jìn)行判定，將不同受損狀態(tài)的細(xì)菌區(qū)分開(kāi)^[8]。基于PCA的載荷圖分析（LPA）可在一定程度上反映引起聚類(lèi)的相關(guān)化學(xué)成分，可幫助尋找關(guān)鍵變量，即能夠?qū)⒉煌瑺顟B(tài)細(xì)菌區(qū)分開(kāi)的那些特定生物化學(xué)組成^[9]。SIMCA方法則是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，有兩個(gè)主要步驟，第一步先建立每一類(lèi)的主成分分析模型，第二步分別將未知樣品與各類(lèi)模型進(jìn)行擬合，以確定未知樣品的類(lèi)別^[10]。SIMCA方法可檢驗(yàn)PCA模型的有效性。

3結(jié)果與討論

3.1平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)熱激后亞致死損傷的副溶血弧菌

圖1是55 ℃熱激處理不同時(shí)間后，副溶血弧菌在非選擇性TSB培養(yǎng)基和選擇性TCBS培養(yǎng)基上的存活曲線，隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，兩種培養(yǎng)基上的活菌數(shù)目均越來(lái)越少；加熱8 min后，非選擇性和選擇性培養(yǎng)基上的活菌數(shù)分別減少了約2.5和4個(gè)數(shù)量級(jí)，表明死亡細(xì)菌數(shù)目增加；在非選擇性培養(yǎng)基上的細(xì)菌始終比選擇性培養(yǎng)基上的細(xì)菌存活數(shù)目多，

隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，兩者的差距越來(lái)越大；未加熱時(shí)，兩者相差約0.3個(gè)數(shù)量級(jí)；加熱8 min后，兩者間的差距已增加至約1.6個(gè)數(shù)量級(jí)。

許多選擇性培養(yǎng)基只能讓正常細(xì)菌在其上生長(zhǎng)，不能修復(fù)受損細(xì)菌，從而無(wú)法檢出；而非選擇性培養(yǎng)基能讓正常細(xì)菌和受損細(xì)菌都在其上生長(zhǎng)，但無(wú)法將二者區(qū)分開(kāi)^[11，12]。同一菌液在兩種培養(yǎng)基上活菌數(shù)目的差異即是亞致死細(xì)菌的數(shù)量^[13]，差異不斷增大，表明更多的細(xì)菌進(jìn)入了亞致死損傷的狀態(tài)。

Ⅰ區(qū)，3000-2800 cm

Symbolm@@ 1是脂質(zhì)烷基的振動(dòng)區(qū)，主要由細(xì)胞膜脂肪酸CH伸縮振動(dòng)引起^[15]。Ⅱ區(qū)，1800-1500 cm

Symbolm@@ 1主要是蛋白質(zhì)和多肽的酰胺基團(tuán)振動(dòng)區(qū)。1655-1637 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰屬于酰胺特征譜帶Ⅰ^[10]，這一譜帶通常是細(xì)菌紅外譜圖中最強(qiáng)的譜帶；1550-1520 cm

Symbolm@@ 1處的吸收峰屬于酰胺特征譜帶Ⅱ^[16]。Ⅲ區(qū)，1500-1200 cm

Symbolm@@ 1是蛋白質(zhì)、脂肪酸和帶磷酸基團(tuán)化合物的混合吸收區(qū)。Ⅳ區(qū)，1200-800 cm

Symbolm@@ 1是細(xì)胞壁多糖的特征吸收區(qū)。1100-950 cm

Symbolm@@ 1處的寬峰由細(xì)胞壁多糖的CO伸縮振動(dòng)產(chǎn)生^[17]。900-600 cm

Symbolm@@ 1為指紋區(qū)。

不同處理的細(xì)菌的原始紅外譜圖幾乎沒(méi)有區(qū)別，這是由于眾多細(xì)胞組分引起譜峰疊加、展寬，使得大部分信息都被隱藏^[8]。將原始紅外譜圖經(jīng)二階導(dǎo)轉(zhuǎn)換后一般能夠?qū)⒅丿B的吸收帶分開(kāi)，找到準(zhǔn)確的峰位置，去除基線漂移，更清楚顯示譜位移和強(qiáng)度變化，從而使不同處理后細(xì)菌的譜圖差異更明顯^[19]。本研究中，不同處理細(xì)菌的二階導(dǎo)數(shù)譜圖幾乎重合，差別極細(xì)微，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)分析進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

3.3熱激后副溶血弧菌的主成分分析（PCA）

PCA分析的最終結(jié)果是用圖形直觀的顯示多維數(shù)據(jù)集中樣本的相似或差異^[8]。在PCA圖中，不同處理的樣本各自聚成一組，說(shuō)明細(xì)菌細(xì)胞的分子組成發(fā)生了變化使得紅外譜圖有顯著差異。提取細(xì)菌二階導(dǎo)數(shù)譜圖4個(gè)特征波段的信息，并分別進(jìn)行PCA分析，其示意圖見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)，4個(gè)光譜區(qū)域中，未受損細(xì)菌都能夠緊密聚成一組，并且與其它加熱處理的細(xì)菌明顯區(qū)分開(kāi)。“未受損”和“加熱8 min”是處理的兩個(gè)極端，在圖4A-D的4張圖中總是分布在第一個(gè)主成分（PC1）的左右兩側(cè)； 而“加熱 2 min”、“加熱4 min”和“加熱6 min”處理則是處于過(guò)渡區(qū)域，說(shuō)明影響PCA的關(guān)鍵在PC1?？傊?，在圖4中，正常細(xì)菌與受損傷細(xì)菌能夠清楚、完全地區(qū)分開(kāi)，而受損傷程度不同的細(xì)菌也能基本分離。

AlQadiri等研究了在60 ℃水浴中熱激處理不同時(shí)間后腸道血清型鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica serotype Typhimurium）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的亞致死損傷^[7]，其SIMCA結(jié)果表明， 兩種細(xì)菌不同程度熱損傷的預(yù)測(cè)率都達(dá)到了80%以上，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

4結(jié)論

顯微紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，可用于熱激后亞致死損傷副溶血弧菌的檢測(cè)，并可將不同程度受損的細(xì)菌區(qū)分開(kāi)，具有靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)；而用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法很可能低估甚至無(wú)法檢出亞致死細(xì)菌。加熱處理后，副溶血弧菌中的多糖、結(jié)構(gòu)蛋白、脂質(zhì)、核酸都發(fā)生了變化，其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和DNA皆遭受損傷，這些變化可能是顯微紅外光譜技術(shù)檢測(cè)亞致死損傷副溶血弧菌的基礎(chǔ)。該技術(shù)也可用于驗(yàn)證加熱處理的有效性，預(yù)測(cè)細(xì)菌的損傷程度，為改進(jìn)現(xiàn)有的殺菌方法和技術(shù)提供理論依據(jù)。

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