摘要[HTSS]實(shí)現(xiàn)吸附于植物葉片表面多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）的現(xiàn)場原位測定，是該研究領(lǐng)域的發(fā)展方向之一。本實(shí)驗(yàn)利用激光誘導(dǎo)納秒時(shí)間分辨熒光（Laserinduced nanosecond timeresolved fluorescence， LITRF）系統(tǒng)，建立了原位測定吸附于秋茄（Kandelia obovata， Ko）、木欖（Bruguiera gymnorhiza， Bg）和桐花樹（Aegiceras corniculatum， Ac）3種紅樹葉片表面菲（Phenanthrene， Phe）的新方法。本方法測定吸附于Ko、Bg和Ac葉片表面Phe的線性范圍分別為2-1400 ng/spot， 1-1000 ng/spot和4-2000 ng/spot，檢測限分別為0.20， 0.14和0.42 ng/spot，加標(biāo)回收率為89.6%-108.1%， 78.2%-92.4%和93.2%-112.9%，且方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.0%（n=9）。將方法用于實(shí)驗(yàn)室暴露樣品的原位測定，并與光纖熒光法對(duì)比，其靈敏度、線性范圍改善顯著，更有利于實(shí)現(xiàn)植物葉片上PAHs的現(xiàn)場原位測定。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞[HTSS]激光誘導(dǎo)納秒時(shí)間分辨熒光； 原位； 紅樹葉片； 菲

[HK][FQ（32，X，DY-W][CD15]20130409收稿；20130522接受

本文系國家自然科學(xué)基金（Nos.21075102， 21177102），廈門大學(xué)基礎(chǔ)創(chuàng)新科研基金， 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（No.CXB2011036）和國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金（No.J1030415）資助項(xiàng)目

Email： yzhang@xmu.edu.cn

1引言

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）是環(huán)境中廣泛分布的一類持久性有機(jī)污染物，可通過大氣傳輸在區(qū)域內(nèi)甚至在全球范圍內(nèi)分布，并可在大氣、水體、土壤和植物等多種介質(zhì)間進(jìn)行交換^[1-3]，其中植物葉片是該類污染物富集和傳輸?shù)闹匾獔鏊?sup>[4，5]。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)具有特殊生態(tài)功能，對(duì)鄰近的海岸帶區(qū)域、特別是河口地區(qū)污染物的去除作用顯著^[6-10]。目前，有關(guān)紅樹林濕地中PAHs的研究多限于分析其在濕地沉積物中的種類、含量、來源和林地內(nèi)微生物對(duì)其降解作用等^[11-13]，直接研究吸附于紅樹葉片上的PAHs卻少見報(bào)道^[14-16]。

植物葉片中PAHs的傳統(tǒng)測定方法^[17-20]雖然選擇性好、靈敏度高，但樣品往往需要較復(fù)雜的前處理步驟，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，消耗大量有機(jī)溶劑，易造成二次污染。更重要的是，破壞性的提取方式難以保存植物中PAHs的原始賦存形態(tài)，所得結(jié)果無法指示PAHs在樣品中的時(shí)空分布。在文獻(xiàn)[14，15]基礎(chǔ)上，光纖熒光法^[16]實(shí)現(xiàn)了紅樹葉片表面PAHs的原位檢測，但在實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場原位檢測方面，該方法的檢測限、檢測范圍有待進(jìn)一步改善。

基于已有工作^[14-16]，以菲（Phenanthrene， Phe）為PAHs代表物質(zhì)，新鮮的紅樹葉片為基質(zhì)，利用激光誘導(dǎo)納秒時(shí)間分辨熒光（Laser induced nanosecond timeresolved fluorescence， LITRF）系統(tǒng)，建立檢測限更低、靈敏度和檢測范圍更佳的原位測定吸附于3種紅樹葉片表面Phe的方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

LITRF系統(tǒng)（德國哥廷根激光實(shí)驗(yàn)室），儀器條件參數(shù)為： Timing start： 75 ns， Timing shift： 1 ns， Lambda excitation： 266 nm， Laser energy： 40 μJ， Time slice： 40， Channels： 674， Cooler temperature：

Symbolm@@ 7 ℃；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國Varian公司）。5 μL平口微量進(jìn)樣器（上海醫(yī)療激光儀器廠），5 mL移液管（上海申立玻璃儀器有限公司）。 Phe （純度>99%，美國Aldrich公司）；丙酮（分析純， 廣東西隴化工股份有限公司）；二氯甲烷（分析純， 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

Phe儲(chǔ)備液：稱取0.1000 g Phe， 用丙酮溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配成1.00 g/L儲(chǔ)備液，儲(chǔ)于4 ℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用逐級(jí)稀釋法配制Phe工作液。

樣品準(zhǔn)備：于漳州龍海紅樹林保護(hù)區(qū)（東經(jīng)：117°29′-118°14′；北緯：24°11′-24°36′；海拔：0 m）采集秋茄（Kandelia obovata， Ko）、木欖（Bruguiera gymnorhiza， Bg）、桐花樹（Aegiceras corniculatum， Ac）3種紅樹胚軸，沙培種植12個(gè)月。摘取成熟度相近的平整葉片用于實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

選取3片外觀相近的葉片，按文獻(xiàn)[16]所述實(shí)驗(yàn)方法，在葉片標(biāo)定位置點(diǎn)加系列濃度的Phe丙酮溶液，保持LITRF系統(tǒng)光纖探頭稍觸及葉片表面，測定葉片前、中、后3個(gè)位置上吸附Phe的熒光強(qiáng)度，取平均值。

2.3實(shí)驗(yàn)室暴露樣品的測定

將8 mg Phe溶于5 mL丙酮，均勻噴于1 L試劑瓶內(nèi)壁，待丙酮揮發(fā)完全后，懸掛放入Ko， Bg， Ac葉片各3片，蓋子密閉，葉片在其中暴露4 h。取出后立刻用LITRF法測定葉片表面Phe的濃度cL；葉片用3×10 mL CH2Cl2超聲提取3 min，合并提取液，濃縮至10.0 mL，靜置至溶液澄清，用熒光分光光度法測定溶液中Phe的濃度，據(jù)葉表面積換算為葉片表面Phe的濃度cF。

3結(jié)果與討論

3.1吸附于紅樹葉片表面Phe的熒光發(fā)射光譜

在266 nm激發(fā)波長下，掃描了吸附于Ko， Bg和Ac紅樹葉片表面Phe的熒光發(fā)射光譜， 圖1和圖2分別為吸附于Ko和Bg葉片表面Phe的熒光發(fā)射光譜圖，吸附于Ac葉片表面Phe的光譜性質(zhì)與Ko相似，故未列出。由兩圖可得，Ko和Bg葉片背景熒光均較弱，不影響其表面Phe的測定。吸附于Ko和Bg葉片表面Phe的最大發(fā)射波長分別為369和368 nm，即相比Bg，吸附于Ko葉片表面Phe的最大發(fā)射波長發(fā)生1 nm紅移，且同濃度Phe在Ko葉片表面的熒光強(qiáng)度高于Bg葉片表面的，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)由Ko葉表層蠟質(zhì)的極性強(qiáng)于Bg所致^[21]。

[TS（]圖1吸附在秋茄葉片表面Phe的熒光發(fā)射光譜

Fig.1Emission spectra of phenanthrene （Phe） adsorbed on Kandelia obovata （Ko） leaves

λex = 266 nm； λem max = 369 nm. 0： 葉片背景（Blank）； 1-7： 100， 300， 500， 700， 900， 1100， 1300 ng/spot Phe.[HT5][TS）]

[TS（]圖2吸附在木欖葉片表面Phe的熒光發(fā)射光譜

Fig.2Emission spectra of Phe adsorbed on Bruguiera gymnorhiza （Bg） leaves

λex = 266 nm； λem max = 368 nm. 0： 葉片背景（Blank）； 1-5： 200， 400， 600， 800， 1000 ng/spot Phe.[HT5][TS）]

作為吸附介質(zhì)的葉片是否具有較低的熒光背景，以及吸附于其表面的PAHs是否具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，是建立原位測定方法應(yīng)考慮的關(guān)鍵因素，而本研究所涉及Ko， Bg和Ac紅樹植物的葉片較好地滿足以上要求，這為建立LITRF法以實(shí)現(xiàn)原位測定吸附于其表面的Phe提供了條件。

3.2工作曲線、線性范圍及檢出限

為實(shí)現(xiàn)定量測定吸附于3種紅樹葉片表面的Phe，配制了系列濃度的Phe丙酮溶液，按照2.2節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法測定了吸附在3種紅樹葉片表面不同濃度Phe的相對(duì)熒光強(qiáng)度。由圖1可見，隨吸附于Ko葉片表面Phe濃度的增加，熒光強(qiáng)度呈線性增加，Bg和Ac的規(guī)律與Ko相似。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，吸附于3種紅樹葉片表面Phe與其相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度呈良好的線性3.3回收率實(shí)驗(yàn)

在測定的3種紅樹葉片表面Phe的線性范圍內(nèi)選擇一個(gè)濃度（c1），加在葉片正面，測其相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度IF1，代入其回歸方程算出Phe的初始測定濃度c1′；然后在原點(diǎn)樣處添加一定量的Phe（200 ng/spot），記該點(diǎn)Phe的總加入量為c2，測其熒光信號(hào)強(qiáng)度IF2，計(jì)算出總測定濃度c2′，根據(jù)公式R%=（c2′-c1′）/（c2-c1） × 100%分別求其回收率（表2）。由表2可知，吸附于3種紅樹葉片表面Phe的回收率為78.2%-112.9%，這表明所建方法的準(zhǔn)確度可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于6.0%，表明方法具有良好的重復(fù)性和精密度。

3.5實(shí)驗(yàn)室暴露樣品的測定結(jié)果

如表4所示，在被Phe污染的空氣中暴露4 h后，利用LITRF法測得3種紅樹葉片表面Phe的平均濃度分別為Ko： 151.90 ng/spot， Bg： 103.56 ng/spot， Ac： 68.18 ng/spot，略高于以超聲提取^[22]常規(guī)熒光法測定的結(jié)果。由于本實(shí)驗(yàn)中LITRF法僅測定了葉片正面Phe濃度作為葉片表面Phe濃度，而常規(guī)熒光法所測為葉片正背面Phe的平均濃度，故兩種方法測定結(jié)果存在差異，主要由葉片正、背面不同的吸附能力所致。已有研究表明，植物葉片吸附PAHs的能力與其表層蠟質(zhì)含量密切相關(guān)，即蠟質(zhì)含量越高，其吸附PAHs容量越大^[23]。Ko， Bg和Ac紅樹葉片正面蠟質(zhì)含量均高于背面^[24]，故其正面Phe的吸附量高于背面。然而，兩方法測定結(jié)果的相對(duì)誤差在10.00%以內(nèi)，表明新建LITRF法可用于直接測定吸附于3種紅樹葉片表面的Phe，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此外，常規(guī)熒光法以葉片整體為研究對(duì)象，無法獲取PAHs在葉片不同位置的分布情況，新建LITRF法彌補(bǔ)了該方面的不足，為原位研究賦存于植物葉片表面不同位置PAHs的環(huán)境行為提供了新方法。

4結(jié)論

利用LITRF系統(tǒng)建立了原位快速測定吸附于紅樹葉片表面PAHs的方法。已知光纖熒光法的檢測限為1.64-5.02 ng/spot^[16]，而本LITRF法為0.14-0.42 ng/spot，其靈敏度提高了近12倍，且線性范圍更寬，在現(xiàn)場原位測定植物葉片樣品中PAHs含量、評(píng)估PAHs區(qū)域污染狀況、考察PAHs在環(huán)境介質(zhì)間交換行為等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，實(shí)際環(huán)境中PAHs大多以多組分混合物形式存在，LITRF系統(tǒng)的時(shí)間分辨功能可為多組分同時(shí)測定提供技術(shù)支持，具有實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場原位檢測多組分PAHs的潛力。

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