嚴(yán)文靜，吳學(xué)東，李俊*

（1.大理學(xué)院護(hù)理學(xué)院，云南大理671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

幼鼠膈肌損傷與漏斗胸發(fā)生的實(shí)驗(yàn)研究

嚴(yán)文靜1，吳學(xué)東2，李俊2*

（1.大理學(xué)院護(hù)理學(xué)院，云南大理671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理671000）

目的：探討幼鼠膈肌損傷后與漏斗胸（PE）發(fā)生的關(guān)系。方法：將40只SD大鼠分成2組，實(shí)驗(yàn)組造成人為膈肌損傷，對(duì)照組施以假手術(shù)，至鼠齡12周全部處死觀察胸廓外觀及膈肌組織學(xué)形態(tài)。結(jié)果：膈肌損傷后，動(dòng)物PE發(fā)生率為38.89%（7/18），實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物PE的發(fā)生率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膈肌損傷后組織愈合結(jié)果為肌纖維結(jié)構(gòu)松散、部分肌組織萎縮，纖維結(jié)締組織增生，瘢痕形成。結(jié)論：膈肌損傷后瘢痕愈合引起膈肌攣縮，攣縮的膈肌持續(xù)牽拉前胸壁，牽拉力量是導(dǎo)致大鼠PE發(fā)生的主要因素之一。

膈肌損傷；漏斗胸；實(shí)驗(yàn)研究；SD大鼠

漏斗胸（Pectus Excavatum，PE）是小兒最常見(jiàn)的前胸壁凹陷畸形，其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，有學(xué)者提出過(guò)前方膈肌纖維化病因假說(shuō)〔1〕，但未見(jiàn)進(jìn)一步的研究報(bào)告。膈肌通過(guò)收縮與舒張?jiān)斐蓪?duì)胸壁的牽拉、改變胸廓內(nèi)負(fù)壓而完成呼吸運(yùn)動(dòng)，故探討膈肌損傷對(duì)胸廓發(fā)育的影響將可能是闡明PE發(fā)生機(jī)制的途徑。本研究通過(guò)手術(shù)造成幼年（Sprague Dawley SD）大鼠膈肌損傷，并對(duì)膈肌損傷后的組織愈合和術(shù)后動(dòng)物前胸壁畸形（PE）的情況進(jìn)行觀察，以期闡釋膈肌攣縮與生長(zhǎng)發(fā)育期幼鼠PE發(fā)生的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料4周齡SD大鼠40只，許可證號(hào)：SCXK（滇）2005-0007。10%水合氯醛溶液，95%醫(yī)用乙醇，萊卡石蠟切片機(jī)，泰克顯微圖像分析儀（TECHPanasonic SDⅡ型）。

1.2 動(dòng)物分組及手術(shù)40只4周齡SD大鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各20只，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)手術(shù)造成膈肌損傷，對(duì)照組僅以假手術(shù)作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組用10%水合氯醛溶液腹膜腔麻醉后右上腹沿肋緣斜行入路，找到右側(cè)膈肌胸骨部及膈肌肋部大部分，用注射器穿刺膈肌并注射95%乙醇0.02 mL，以漿膜下注射為度，術(shù)中不能刺穿膈肌，并在注射部位以95%乙醇涂擦做為加強(qiáng)。對(duì)照組麻醉成功后，僅以右上腹斜切口進(jìn)入腹腔后不進(jìn)行任何干預(yù)后關(guān)腹。術(shù)后籠內(nèi)飼養(yǎng)至鼠齡12周后全部處死。

1.3 取材和組織學(xué)研究術(shù)后觀察記錄胸廓外觀變化，兩組動(dòng)物于鼠齡12周時(shí)全部處死，取膈肌胸骨部及右肋部組織作HE染色。在顯微鏡下與對(duì)照組比較觀察膈肌肌細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法前胸壁畸形發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0軟件完成，以P< 0.05為檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組20只大鼠實(shí)際獲得觀察18只，因在鼠齡滿(mǎn)8周前共死亡2只，均因術(shù)后2周后發(fā)生膈疝，未發(fā)生PE。術(shù)后直至12周處死時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，共出現(xiàn)PE7只。對(duì)照組無(wú)動(dòng)物死亡，亦無(wú)PE發(fā)生。

2.1 PE的發(fā)生率膈肌損傷術(shù)后1周內(nèi)大鼠前胸壁外觀無(wú)明顯變化；術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組有7只SD大鼠切口上方前胸壁出現(xiàn)輕度的PE；至鼠齡8周PE隨周齡增加有所加重，而鼠齡8周后PE趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖1。在鼠齡12周處死時(shí)，7只大鼠PE外觀未見(jiàn)好轉(zhuǎn)及加重，其余動(dòng)物未出現(xiàn)PE。對(duì)照組未發(fā)生PE。實(shí)驗(yàn)組PE發(fā)生率為38.89%，兩組發(fā)生率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

圖1 右肋下胸廓不規(guī)則凹陷

表1 兩組前胸壁外觀觀察結(jié)果

2.2 膈肌損傷后組織愈合情況膈肌損傷的大鼠（取材為術(shù)后2周因膈疝死亡的大鼠標(biāo)本）術(shù)后第2周時(shí)，肉眼下膈肌組織的手術(shù)區(qū)域與肝臟膈面黏連，且肉芽組織增生，色鮮紅，顆粒狀，柔軟濕潤(rùn)，膈肌不規(guī)則增厚，光鏡下手術(shù)區(qū)域見(jiàn)新生肉芽組織增生，新生壁薄的毛細(xì)血管豐富及增生的成纖維細(xì)胞，并有聚集成團(tuán)、深染的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；取材鼠齡12周的標(biāo)本，膈肌組織手術(shù)區(qū)域與肝臟膈面嚴(yán)重黏連，不易分離，表面凹凸不平，局部呈收縮狀態(tài)，顏色較周?chē)＝M織蒼白，肌肉質(zhì)地稍硬，彈性較差。光鏡下組織內(nèi)幾乎無(wú)血管，由大量的平行或交錯(cuò)分布的膠原纖維束組成，纖維束呈均質(zhì)紅染即玻璃樣變，部分肌組織萎縮，肌纖維結(jié)構(gòu)松散，走行紊亂，纖維結(jié)締組織比例增多，見(jiàn)圖2。對(duì)照組膈肌表面光滑，顏色粉紅，柔軟彈性好，光鏡下纖維呈細(xì)長(zhǎng)的圓柱狀或棱柱狀，排列致密、走行規(guī)則，見(jiàn)圖3。解剖大鼠胸腔觀察，膈肌組織手術(shù)區(qū)域與胸膜腔及腔內(nèi)臟器均未發(fā)生黏連。

圖2 肌萎縮橫切面HEx100

圖3 正常膈肌橫切面HEx100

3 討論

人類(lèi)PE畸形約90%可在出生后1年內(nèi)發(fā)現(xiàn)，隨年齡增大而加重，畸形變得不對(duì)稱(chēng)〔2〕。典型表現(xiàn)為深吸氣時(shí)有胸骨向脊椎方向凹陷的異常反應(yīng)〔3〕。許多學(xué)者提出了多種病因假說(shuō)或?qū)W說(shuō)〔4-5〕，但PE的病因和發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明〔6〕，因此嚴(yán)重制約了臨床對(duì)PE本質(zhì)的認(rèn)識(shí)和防治措施的實(shí)施。絕大多數(shù)PE出現(xiàn)于出生之后一年內(nèi)，這提示在從胎兒到新生兒的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，特別是肺呼吸功能的啟動(dòng)，氣道、肺、呼吸肌和骨性胸廓的發(fā)育狀況、各自功能的開(kāi)始及它們之間工作的協(xié)調(diào)性等，都可能在PE的發(fā)生過(guò)程中起作用〔7〕。

3.1 膈肌攣縮后的病理生理改變骨骼肌纖維是高度分化的細(xì)胞，再生能力很弱。若遭受損傷纖維斷裂肌膜被破壞，將不能再生而由結(jié)締組織增生充填，形成疤痕修復(fù)。膈肌具有骨骼肌的生理結(jié)構(gòu)及功能，可參考其他骨骼肌的攣縮機(jī)制，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)膈肌攣縮后的病理改變，探討可能發(fā)生的膈肌形態(tài)及功能改變。臨床上有關(guān)骨骼肌攣縮的探討，較多的有臀肌攣縮等疾病，基本病理變化為骨骼肌纖維化，肌纖維的退行性變性和肌纖維纖維化，瘢痕組織形成，導(dǎo)致機(jī)體外觀改變及骨骼肌功能減退〔8〕，與本實(shí)驗(yàn)膈肌的組織學(xué)病理改變相似。王靖等〔9〕對(duì)本實(shí)驗(yàn)的PE幼鼠膈肌，通過(guò)SDS聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳結(jié)合westem印跡分析，檢測(cè)膈肌MyHC-Ⅱa的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC-Ⅱa表達(dá)減少，提示在PE形成過(guò)程中發(fā)生了膈肌纖維結(jié)構(gòu)和功能的改變。

3.2 SD大鼠PE的觀察目前尚無(wú)SD大鼠PE的評(píng)判及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)量大鼠胸廓前后徑和橫徑，并參照人類(lèi)評(píng)價(jià)胸廓形狀的胸廓橫徑與前后徑之比值進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物胸廓有從桶狀胸向扁平胸再向PE改變的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)〔10〕報(bào)道在小兒PE病例中扁平胸與漏斗胸并存，且年齡越大胸廓扁平程度越明顯的結(jié)論一致。正常大鼠的胸廓為前后徑大于橫徑的類(lèi)似雞胸狀〔11〕，且為匍匐爬行狀態(tài)，肋骨在長(zhǎng)期重力作用下生長(zhǎng)，較人類(lèi)更不易發(fā)生前胸壁凹陷，本實(shí)驗(yàn)手術(shù)實(shí)施后，以自然方式籠養(yǎng)未采用限制性仰臥體位，仍有7只大鼠出現(xiàn)PE，這說(shuō)明手術(shù)干預(yù)方式對(duì)PE的形成是有效的。

3.3 膈肌攣縮后漏斗胸形成的機(jī)制在幼鼠期有兩方面的解剖生理因素，可能促進(jìn)了PE的發(fā)生。一是初生時(shí)的呼吸運(yùn)動(dòng)主要靠膈肌的舒縮來(lái)實(shí)現(xiàn)，故膈肌的牽拉對(duì)胸廓的影響相對(duì)強(qiáng)大。二是肋軟骨及胸骨處于生長(zhǎng)發(fā)育期，前胸壁骨性組成以軟骨結(jié)構(gòu)為主，抗彎曲能力較弱〔11〕，脆弱的胸廓塑型尚未穩(wěn)定。基于以上兩個(gè)因素，損傷后的膈肌，因攣縮而增強(qiáng)了對(duì)前胸壁肋骨附著點(diǎn)牽拉的力量，在持久向后牽拉的作用下，胸骨旁下位肋骨向脊柱方向凹陷，胸廓重新塑型并固定，形成PE。吳學(xué)東〔12〕通過(guò)切斷SD大鼠胸骨旁下位3對(duì)肋軟骨，復(fù)制出PE動(dòng)物模型，并認(rèn)為PE成因與膈肌對(duì)前下胸壁的牽拉作用有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中有38.89%的動(dòng)物出現(xiàn)PE，而對(duì)照組未發(fā)生，提示攣縮的膈肌向后牽拉相應(yīng)肋骨，能誘發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育期的幼鼠發(fā)生PE。同時(shí)，術(shù)后膈肌組織手術(shù)區(qū)域與鄰近的肝臟膈面嚴(yán)重黏連后，加固膈肌的攣縮，膈肌呼吸運(yùn)動(dòng)被限制，也可能在PE的形成過(guò)程中起到一定的推動(dòng)作用。

實(shí)驗(yàn)組大鼠8周齡前出現(xiàn)PE7例，生長(zhǎng)至12周齡時(shí)PE畸形并無(wú)進(jìn)展或消退，同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)有新增畸形例數(shù)，結(jié)合大鼠生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律分析，在8周齡后大鼠已從幼鼠過(guò)渡為成鼠，骨骼不再增粗增長(zhǎng)，骨性胸廓基本固定，由此可推測(cè)，攣縮的膈肌持續(xù)牽拉而造成PE主要在8周齡前形成，8周齡可能是干預(yù)的分界點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)。

3.4 實(shí)驗(yàn)研究的拓展空間在本實(shí)驗(yàn)中并非所有實(shí)施膈肌損傷的大鼠都形成了PE，這提示PE不是由單一原因引起的單純的疾病〔13〕，而是多種疾病共有的一個(gè)臨床表現(xiàn)，因此仍然存在PE的眾多病因假說(shuō)（如膈肌中心腱短縮、部分前方膈肌纖維化、骨和肋軟骨發(fā)育障礙、結(jié)締組織異常等）〔14〕，目前還沒(méi)有一種假說(shuō)能完全解釋PE的病因，但本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為只要這些疾病能使膈肌產(chǎn)生足以持續(xù)向后牽拉胸骨、肋骨的力量，就有發(fā)生PE的可能。這就使我們有了可拓展的研究空間，在下一步PE的病因?qū)W探討中，應(yīng)著眼于是什么原因或疾病導(dǎo)致膈肌肌力和方向的改變，以及從分子水平探究膈肌肌力是如何改變的。

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（責(zé)任編輯 李楊）

Experimental Study of the Pectus Excavatum after Diaphragm Injury in Juvenile Rats

YAN Wenjing1,WU Xuedong2,LI Jun2*
（1.College of Nursing,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the relationship of diaphragmatic injury and pectus excavatum in rats.Methods:Forty SD rats were divided into 2 groups,intervene group received the operation of injury diaphragm,and the control group received the sham operation. At the age of 12 weeks,all rats were sacrificed for observations of the chest appearance and histology and morphology of diaphragm. Results:The incidence rate of the pectus excavatum in intervened SD rats was 38.89%（7/18）after diaphragm contracture. Compared to the control group,the incidence rates were different with statistic significance.The muscle fiber structure was loose and disordered;the muscular atrophy,hyperplasia of fibrous connective tissue and scar formation were found in diaphragm injure. Conclusion:Injuried diaphragm led to contracture after diaphragm cicatricle healing,the contracture of diaphragm created a continuous stretch power on anterior chest wall,the force may be one of the factors which induce pectus excavatum.

diaphragm injury;pectus excavatum;experimental research;SD rats

R332

A

1672-2345（2013）06-0027-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.008

2013-01-26

2013-03-31

嚴(yán)文靜，講師，主要從事兒科臨床及兒童保健研究. *通信作者：李俊，副教授.