王文君，劉 姚，陳婷婷，葉振南，傅凌韻

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045)

隨著人們生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高血脂癥悄然地擠身于富貴文明病行列當(dāng)中，嚴(yán)重者發(fā)展為心腦血管方面的疾?。?］。進(jìn)一步的研究表明，個體遺傳背景的不同可能會導(dǎo)致部分個體對引起高脂血癥的某些環(huán)境因素(如飲食)更加易感，高脂血癥的發(fā)生是營養(yǎng)素與基因相互作用的結(jié)果。膳食對高脂血癥的影響可通過影響相關(guān)基因表達(dá)，包括基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的影響而實現(xiàn)，但人們高度重視該過程的具體調(diào)控細(xì)節(jié)還不清楚［2］。通過營養(yǎng)與遺傳基因互作的研究可加深對慢性疾病更深層次的認(rèn)識［3］。

脂肪酸合成酶(FAS)是一個由單基因編碼多肽的單鏈多功能酶，包括丙二酰基轉(zhuǎn)移酶(MT)、β－酮脂酰合酶(KS)、β－酮脂酰還原酶(KR)、乙?；D(zhuǎn)移酶(AT)、β－羥脂酰脫水酶(HD)、烯脂酰還原酶(ER)及硫酯酶(TE)等7個功能域，它可分為I型和Ⅱ型兩種亞型。人類及其他哺乳類動物的FAS屬I型，是由包括以上7個功能域組成，相對分子質(zhì)量為250 ku［4］。FAS是生物體內(nèi)源性脂肪酸合成過程的關(guān)鍵酶，它通過催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸［5］，F(xiàn)AS基因的表達(dá)直接影響著脂肪酸合成酶的多寡。

FAS基因在多種組織和器官中都有表達(dá)，其中在肝臟、肺臟和腹腔脂肪組織中表達(dá)較高。其功能是將碳水化合物合成脂肪酸，以甘油三酯的形式儲存。在正常的生理狀態(tài)下，環(huán)境因素如飲食和激素可調(diào)節(jié)FAS的表達(dá)和含量。碳水化合物的攝取，甲狀腺、胰島素、糖皮質(zhì)激素均可提高FAS的表達(dá)和脂肪酸合成，而不飽和脂肪酸、cAMP、胰高血糖素則會下調(diào)FAS和脂肪酸合成［6］。為了探討環(huán)境因素(如飲食)和基因互相作用對個體的影響，本文研究了FAS基因多態(tài)與高脂乳劑互作對昆明種小鼠與脂質(zhì)代謝相關(guān)性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

高脂乳劑(膽固醇10%，豬油89%，膽酸鈉1%，適量吐溫-80，高速組織勻漿機(jī)搗碎);120只2月齡昆明種小鼠(江西醫(yī)學(xué)院動物實驗部提供，合格證號:021-9601)。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水飲食，飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照時間(12 hr/24 hr)，于第7天(D0)測定基礎(chǔ)血脂指標(biāo)總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游離脂肪酸(FFA)和脂肪酶(LPS)。隨后取20只小鼠作為對照組，只喂基礎(chǔ)日糧;另外200只作為試驗組，采取灌胃法，每日對小鼠灌喂適量高脂乳劑，連續(xù)一個月后(D30)，測定血脂指標(biāo)(TC、TG、HDL、LDL、FFA、LPS)，比較對照組和試驗組TC值，發(fā)現(xiàn)兩組TC值差異顯著(結(jié)果未列出)，證明高血脂小鼠建模成功。采集小鼠尾組織，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，－70℃保存?zhèn)溆?。采集小鼠心、肝、脾、腎、肺，脂肪并稱重。

1.2.2 血脂性狀的測定 小鼠空腹眼眶靜脈采血后收集血漿于離心管中，4℃，3500 rpm離心10min，分離血清。除立即檢測指標(biāo)外，其余血清樣品分裝于1.5mL EP管中，－20℃冰箱冷貯待檢相關(guān)生化指標(biāo)。TC含量測定采用酶比色法，參照總膽固醇試劑盒(CHO)測定方法;TG含量測定采用酶比色法，參照甘油三脂試劑盒(TG)測定方法;LDL-C含量測定采用聚乙烯硫酸沉淀法，參照低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(LDL-C)測定方法;HDL-C含量測定采用磷鎢酸－鎂沉淀法，參照高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(HDL-C)測定方法;NFFA含量測定采用比色法，參照游離脂肪酸測試盒(NFFA)測定方法;LPS含量測定采用比色法，參照脂肪酶測試盒(LPS)測定方法。所有試劑盒都購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2.3 基因組DNA的提取 于小鼠尾組織提取基因組DNA，提取方法參照實驗室此前建立的方法［7］。

1.2.4 PCR-RFLP 過程 (1)引物:引物設(shè)計根據(jù) FAS 序列(GenBank accession No.ref|NT_039687.7)，采用DNAman(version 3.0)設(shè)計引物，所擴(kuò)增的目的片段長度550 bp(GenBank accession ref NT_039687.7)，引物由上海生工合成，序列為:

(2)PCR 擴(kuò)增:25μL PCR 擴(kuò)增體系為:滅菌雙蒸水17.7μL，10 ×PCR buffer(含 MgCl2)2.5μL，2mmol/L dNTPs 1.8μL，引物1.0μL，5 U/μL Taq 酶1.0μL，DNA 模板1.0μL。PCR 程序為:94 ℃ 5min;94 ℃變性45 s，59.7℃退火45 s;延伸72℃ 45 s，共36個循環(huán);72℃延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀檢測結(jié)果。

(3)PCR 產(chǎn)物的酶切:取8μL PCR 產(chǎn)物，加入0.3μL 限制性內(nèi)切酶 Af1Ⅱ，0.6μL 10 ×Loading buffer，補(bǔ)足超純水至終體積為15μL，37℃溫浴5～7 h或過夜。

酶切產(chǎn)物的電泳檢測:向每管反應(yīng)體系中加2μL酶試劑盒附帶的10×Loading buffer，混勻，于2.5%瓊脂糖凝膠電泳。紫外透照臺觀察結(jié)果并在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用x2檢驗分析了在所試群體中基因型頻率分布是否處于Hardy-Weinberg平衡。并采用下列固定模型進(jìn)行基因型與血脂性狀的相關(guān)性分析

式中:Yij是個體的觀察值，μ是群體的均值，Gi基因型的估計效應(yīng)，eij是殘差效應(yīng)。采用SAS統(tǒng)計軟件(version 6.01)中的LSM法進(jìn)行基因型與性狀的相關(guān)分析，并采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR-RFLP 分析結(jié)果

用所設(shè)計的引物以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增獲得了較好的結(jié)果，片段長度(圖1)與預(yù)期大小一致，且沒有非特異性條帶。根據(jù)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)已知的小鼠SNP數(shù)據(jù)庫(rs52586864 mouse FAS)可知，27486082處有一個突變(T→C)，該突變存在Af1Ⅱ酶切位點，可以進(jìn)行RFLP分析。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，產(chǎn)生T/T、T/C和C/C 3種基因型(圖2)。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR

2.2 不同基因型與血脂水平的關(guān)聯(lián)性分析

經(jīng)統(tǒng)計，在所分析的200只小鼠群體中，CC基因型小鼠145只，占72.5%，CT基因型小鼠44只，占22%，TT基因型小鼠11只，占5.5%(表1);C等位基因的頻率為83.5%，T等位基因的頻率為16.5%。x2檢驗分析表明，基因型頻率分布顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(x2=68.41＞x20.01=9.21，P ＜0.01)

在對血脂性狀的相關(guān)性影響的統(tǒng)計分析表明，不同基因型對血液中TC、TG、LDL、HDL、FFA和LPS濃度的影響存在一定的差異(表1)。D0天，3種基因型小鼠的TC和TG水平均不存在差異，但在D30天，TT基因型小鼠的TC和TG水平均高于CC基因型，差異顯著(P＜0.05);LDL-C的水平在飼喂高脂日糧后均沒有3種基因型間均不存在顯著差異，但TT基因型小鼠的LDL-C水平仍高于CC基因型小鼠。相反，在對HDL的影響中，D0天，CC基因型小鼠的HDL水平高于CT和TT基因型，但無顯著性差異;D30天，CC和CT基因型小鼠的HDL水平高于TT基因型的小鼠，差異顯著(P＜0.05)。而不同基因型在D30天對血清FFA也有顯著的影響，其中CC基因型小鼠血清FFA水平顯著低于CT和TT基因型，差異極顯著(P＜0.01);但不同基因型對脂肪酶的活性影響不顯著。

2.3 不同基因型對小鼠各器官性狀的影響

由于患高血脂癥可能會導(dǎo)致其他并發(fā)癥的產(chǎn)生，為此，分析了不同基因型對體重、心/體重、肝/體重脾/體重、腎/體重、肺/體重的比值的影響(表2)。從表2中可以發(fā)現(xiàn)，不同基因型對體重、肝重、肝重/體重、脾重、脾重/體重、腎重、腎/體重、肺重、肺/體重的影響差異不顯著(P＞0.05);而不同基因型卻可顯著影響心重(P＜0.05)和心重/體重的比值(P＜0.01);脂肪重和脂肪重/體重(P＜0.05)，其中以CC基因型的最小。這些結(jié)果也提示了在對脂肪的代謝中，肝臟是一個重要的器官，同時體脂的沉積，也會影響心臟的重量。

表1 小鼠FAS基因不同PCR-RFLP-Af1Ⅱ(FAS)基因型對血脂水平的影響(mmol/L)Tab.1 Effect of FAS PCR-RFLP-Af1Ⅱ genotype on the blood fat level

表2 小鼠FAS基因不同PCR-RFLP-Af1Ⅱ(FAS)基因型對各器官的影響Tab.2 Effect of FAS PCR-RFLP-Af1Ⅱ genotype on the organs

3 討論

本研究以高脂乳劑喂養(yǎng)正常小鼠，擬使其患高血脂癥。喂養(yǎng)1個月后，與對照組相比，試驗組TC值顯著升高。以FAS基因作為小鼠血脂水平和部分器官性狀的候選基因，在27486082 bp處發(fā)現(xiàn)C→T的突變，檢測到2種等位基因(T和C)，3種基因型(TT、TC和CC)，其中TC和TT為突變基因型。

脂肪酸合成酶(FAS)作為細(xì)胞脂肪代謝的主要的酶，參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展。Loftus等［8］給小鼠腹腔注射FAS抑制劑，能降低小鼠食欲、減少能量攝入，顯著減輕小鼠體重，說明FAS與脂肪調(diào)控之間存在重要聯(lián)系。曾凡勇等［9］探討高脂飲食誘導(dǎo)下肥胖易感(OP)與肥胖抗性(OR)大鼠白色脂肪組織中脂肪酸合成酶的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)OP與OR大鼠的白色脂肪組織中存在FAS基因表達(dá)差異，其差異與大鼠發(fā)生肥胖的易感程度有關(guān)。在普洱茶的降脂減肥的作用機(jī)理方面，Chiang等［10］報道，灌喂普洱茶的大鼠肝臟內(nèi)脂肪酸合成酶的表達(dá)量得到顯著抑制，人肝腫瘤HepG2細(xì)胞在加入普洱茶提取物后，在蛋白和mRNA水平上，脂肪酸合成酶表達(dá)都得到抑制。孫悅等［11］在高甘油三酯高血糖血癥大鼠脂糖代謝相關(guān)酶活性變化的實驗研究中得出模型組動物肝中FAS活性顯著升高，提示FAS活性升高可能是模型動物出現(xiàn)高甘油三酯高血糖血癥的原因之一。倪紅玉等［12］探討了不同油脂對肉仔雞脂類代謝及相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同油脂可以影響FAS mRNA的表達(dá)，同時對血清脂肪酶的活性產(chǎn)生影響。

Roy等［13］研究了FAS基因的多態(tài)性及其與牛乳脂含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在外顯子1處的G到C的顛換(g.763G＞C)可改變一個潛在的sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;在外顯子34處的A到G的轉(zhuǎn)換(g.16009A＞G)，從而導(dǎo)致了一個非保守的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸。進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)這兩個SNPs在具有高和低的乳脂含量育種值的荷斯坦奶牛中的基因頻率分布具有顯著的差異。由外顯子1(等位基因G和C)和外顯子34(等位基因A和G)組成的單倍型處于連鎖不平衡狀態(tài)。所以Roy等認(rèn)為FAS基因是乳脂含量QTL的一個候選基因。Chris等［14］通過連鎖分析對在牛19號染色體上QTL進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為FAS是這個QTL的候選基因，且與脂肪和乳脂存在相關(guān)性。Sourdioux等［15］對火雞商品系的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS的多態(tài)與瘦肉率的高低存在相關(guān)性。張磊等［16］以FAS為候選基因，采用PCR-SSCP方法對FAS的SNP不同基因型與朗德鵝的肥肝性能進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明FAS基因可以作為鵝肥肝性狀的候選分子遺傳標(biāo)記。

基因與環(huán)境的交互作用是指在同樣的環(huán)境中，不同的基因型作用是不一樣的，或者某些基因型相對于另外的基因型對環(huán)境改變的敏感度更高［17］。本研究選取了脂肪酸合成酶(FAS)的Af1Ⅱ多態(tài)性位點，應(yīng)用PCR-RFLP方法，旨在探討FAS-Af1Ⅱ基因多態(tài)性與高脂血癥的關(guān)系。FAS基因在27486082處有一個突變(T→C)產(chǎn)生，在FAS基因的Af1Ⅱ酶切位點上，昆明種小鼠大多數(shù)個體表現(xiàn)為CC型，個別為TT型。不同F(xiàn)AS基因型對小鼠的血脂性狀具有不同的影響，特別是對于與脂質(zhì)代謝相關(guān)的組織器官如脂肪組織重具有顯著的影響(P＜0.01)。

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