肖旭峰，王 恒，黃 敏，雷建軍

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510128;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045)

cDNA－AFLP(cDNA amplified fragment length polymorphism)技術(shù)的出現(xiàn)是RNA指紋技術(shù)重大突破。該技術(shù)以mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為研究對(duì)象，具有重復(fù)性好、靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)生物體轉(zhuǎn)錄組可進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，目前仍被用于分析轉(zhuǎn)錄組，尋找差異表達(dá)基因最有效的手段之一［1］，現(xiàn)已從牽牛花、馬鈴薯、大白菜、玉米、棉花等植物中分離和克隆了多個(gè)有價(jià)值的基因［2］。

菜心 (Brassica rapa syn.campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)是目前我國(guó)華南地區(qū)栽培規(guī)模最大的特產(chǎn)蔬菜之一［3］。菜心的花薹形成是一種抽薹現(xiàn)象，植株從花芽分化至開花的整個(gè)過(guò)程，經(jīng)歷了花芽形成、促進(jìn)花芽發(fā)育、花芽成熟、抽薹及開花等過(guò)程［4］，可能涉及到多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控。利用cDNA－AFLP技術(shù)分離獲得調(diào)控菜心抽薹的功能基因，從分子水平上調(diào)控功能基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)菜心花薹形成，從而達(dá)到提高菜心經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的目標(biāo)，是一個(gè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義的課題。然而，cDNAAFLP技術(shù)的操作要求較高，過(guò)程較繁瑣。整個(gè)流程從總RNA提取，雙鏈cDNA合成，限制性內(nèi)切酶酶切，接頭連接，預(yù)擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增至PAGE電泳，中間每個(gè)步驟環(huán)環(huán)相扣，任何細(xì)節(jié)都可能影響到整個(gè)實(shí)驗(yàn)成?。?－7］，因此優(yōu)化和建立適合菜心cDNA－AFLP的反應(yīng)體系顯得尤其重要。本文以菜心頂端分生組織為試材，對(duì)cDNA－AFLP反應(yīng)體系中關(guān)鍵影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適用于菜心抽薹相關(guān)基因分離研究的反應(yīng)體系，為菜心抽薹的分子機(jī)理進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為菜心早熟品種“油青49”及晚熟品種“油青甜菜心80天”，于2011年春季種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地，取第一、二、三、五片真葉及開花5個(gè)時(shí)期頂端分生組織(生長(zhǎng)點(diǎn))，液氮處理后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trizol試劑(Invitrogen 公司);Power ScriptTMReverse Transcriptase、Advantage 2 Polymerase Mix(CLONTECH公司;限制性內(nèi)切酶Taq I與Ase I(NEB公司);T4連接酶、Taq酶、dNTPs、DL2000等(寶生物工程(大連)有限公司);水飽和酚、親和硅烷、剝離硅烷、尿素、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺等(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 接頭及相關(guān)引物

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的引物序列參考BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書，引物AFLP分析用接頭和引物見表1，接頭與引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 RNA提取與cDNA合成 采用Trizol法分離純化菜心頂端分生組織總RNA，具體步驟參照Invitrogen公司Trizol Reagent說(shuō)明書進(jìn)行，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。雙鏈cDNA合成步驟則參照CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library construction kit說(shuō)明書。

1.4.2 cDNA的酶切與接頭連接 采用Taq I和Ase I兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)cDNA進(jìn)行分步酶切。先用TaqI酶切，酶切溫度65℃，3 h。體系為cDNA(約100 ng)8μL，Taq I(10 U)1μL，10×NEB buffer 32μL，10 ×BSA 0.2μL，補(bǔ)充ddH20 至總體積20μL;然后再用Ase I酶切，溫度為37℃，3 h。在上述酶切體系中加入Ase I(10 U)1μL，10×Ase I buffer 1μL，補(bǔ)充ddH20至總體積30μL，37℃再保溫酶切3 h。雙酶切結(jié)束后，取8μL酶切產(chǎn)物用于電泳，檢測(cè)是否酶切完全。

表1 cDNA-AFLP接頭與引物核苷酸序列Tab.1 Adapters and primers sequence of cDNA-AFLP analysis system

對(duì)雙酶切產(chǎn)物連接接頭，其體系為雙酶切后的產(chǎn)物22μL，Taq I(50μmol/L)接頭1μL，Ase I(5μmol/L)接頭 1μL，T4Linkage buffer 3μL，T4連接酶 1μL，最后補(bǔ)充 ddH20 至總體積 30μL，16 ℃恒溫槽下連接過(guò)夜。取5μL于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

圖1 菜心頂端分生組織總RNA電泳Fig.1 Total RNA analysis from shoot tips

圖2 反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNAFig.2 The amplification of double－strand cDNA

1.4.3 PCR體系優(yōu)化 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:連接產(chǎn)物5μL，模板稀釋倍數(shù)分別設(shè)定了5、10、15、20倍 4 個(gè)梯度用于預(yù)擴(kuò)增，上、下游引物各 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL(不含 Mg2+)，Mg2+(25mmol/L)分別篩選 1.5，1.8，2.0，2.5μL 4 個(gè)梯度，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，Taq 酶(5 U)0.4μL，補(bǔ)充 ddH20至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性1min;94℃ 30 s，退火溫度分別篩選52，54，56，58℃ 4個(gè)梯度，循環(huán)數(shù)設(shè)定15、18、21、24、27和306個(gè)梯度，72℃延伸1min，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選最佳預(yù)擴(kuò)增體系。

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系與最佳預(yù)擴(kuò)增體系相同，用選擇性擴(kuò)增引物代替相應(yīng)的預(yù)擴(kuò)增引物，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增的模板。

反應(yīng)結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物用Bio-Rad公司POWER PAC3000垂直電泳儀電泳，電泳溫度設(shè)定為45℃，80 W恒定功率電泳約90min。銀染顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及雙鏈cDNA合成

高純度及完整性好的總RNA制備是cDNAAFLP成功的關(guān)鍵，尤其對(duì)低表達(dá)豐度基因的分離［8］。由圖1可知，利用 Trizol法提取的菜心總RNA帶型清晰整齊，點(diǎn)樣孔干凈，沒(méi)有拖尾和彌散，28 S寬度和亮度約是18 S的2倍，表明該方法提取的總RNA完整性好，雜質(zhì)去除徹底，適用于雙鏈cDNA合成。

雙鏈cDNA合成是cDNA－AFLP技術(shù)體系中一個(gè)重要的限速步驟，雙鏈cDNA質(zhì)量好壞與后續(xù)實(shí)驗(yàn)成敗有直接地關(guān)系［4］。根據(jù)CLONTECH公司發(fā)明的SMART法技術(shù)原理，將獲得的總RNA為模板，省略了mRNA純化步驟，也能成功獲得帶型清晰明亮，彌散帶分布于0.5～8 kb的雙鏈cDNA，表明該試劑盒方法合成菜心cDNA雙鏈完全能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，其中合成的最佳循環(huán)數(shù)為24個(gè)(圖2)。

圖3 雙鏈cDNA酶切電泳結(jié)果Fig.3 The products of double－strand cDNA

2.2 酶切檢測(cè)

雙鏈cDNA是否被完全酶切是影響cDNA－AFLP多態(tài)性信息量準(zhǔn)確的根本保證［9］。TaqI和AseI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶被廣泛應(yīng)用在不同物種中的雙鏈cDNA酶切。由圖3可知，cDNA條帶呈均勻的彌散狀;與未酶切產(chǎn)物相比，酶切后cDNA片段分布范圍已明顯減小，且大部分聚集在100～1000 bp，說(shuō)明雙鏈cDNA酶切較徹底，適合下一步接頭連接與多態(tài)性擴(kuò)增。

2.3 預(yù)擴(kuò)增體系優(yōu)化

預(yù)擴(kuò)增的目的是為了純化模板，為下一步選擇性擴(kuò)增作準(zhǔn)備［10］。分別對(duì)影響預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵因子，如模板稀釋倍數(shù)、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、退火溫度及Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。連接產(chǎn)物稀釋5、10、15和20倍后對(duì)預(yù)擴(kuò)增影響結(jié)果較顯著。稀釋20倍模板獲得產(chǎn)物彌散帶范圍更大，亮度更強(qiáng)，說(shuō)明20倍是該反應(yīng)中最佳模板稀釋倍數(shù)(圖4A)。不同循環(huán)次數(shù)(圖4B)對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的影響也較大，條帶亮度隨循環(huán)數(shù)增加而增強(qiáng)，其中27個(gè)循環(huán)數(shù)擴(kuò)增的條帶亮度最強(qiáng)，效果最佳。預(yù)擴(kuò)體系中分別加入Mg2+(25mmol/L)1.5，1.8，2.0，2.5μL，，篩選最適宜的 Mg2+量，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Mg2+對(duì)預(yù)擴(kuò)增影響較大(圖 4C)，其中加入了2.5μL Mg2+(25mmol/L)的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最亮，且均勻一致，是最佳Mg2+用量。篩選不同的退火溫度對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的影響，結(jié)果差異不大。從圖4D可知，50～58℃均適合于預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。

圖4 預(yù)擴(kuò)增體系優(yōu)化電泳檢測(cè)Fig.4 Improvement of pre－amplification system

2.4 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

選擇性擴(kuò)增是從擴(kuò)增產(chǎn)物中篩選出能被合適引物組合選擇性堿基識(shí)別的片段，結(jié)果通常用高分辨PAGE電泳檢測(cè)［11］。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳及PAGE電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的主帶清晰明亮，擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度基本一致，擴(kuò)增條帶密度分布均勻，且主要分布于100～800 bp(圖5)，說(shuō)明通過(guò)優(yōu)化影響菜心cDNAAFLP分析體系關(guān)鍵因子，建立了適合菜心抽薹開花相關(guān)基因分離反應(yīng)體系，為深入研究菜心抽薹分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

圖5 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及PAGE電泳檢測(cè)Fig.5 The products of selective amplification by gel Electrophoresis

3 討論

高質(zhì)量RNA及雙鏈cDNA合成均是cDNA－AFLP分析基因差異表達(dá)的關(guān)鍵因子。完整的RNA能正確地反映作物的轉(zhuǎn)錄組信息［12］。利用Trizol法獲得菜心的總RNA，其點(diǎn)樣孔干凈，沒(méi)有拖尾與彌散，表明蛋白質(zhì)污染少，質(zhì)量較高，符合菜心cDNA－AFLP實(shí)驗(yàn)要求。SMART法是目前雙鏈cDNA合成應(yīng)用較廣泛的方法之一，該方法直接利用作物總RNA為模板，合成高質(zhì)量、高產(chǎn)量的雙鏈cDNA，省略了mRNA純化步驟，從而降低了實(shí)驗(yàn)成本，減少了基因信息丟失或改變［13－14］，適合菜心抽薹轉(zhuǎn)錄組的差異分析。其次，應(yīng)用經(jīng)典雙酶組合Taq I/Ase I對(duì)菜心雙鏈cDNA進(jìn)行酶切，獲得的酶切片段是隨機(jī)的，通常幾十至數(shù)千個(gè)堿基的跨度，但大部分集中于100～1000 bp，是cDNA－AFLP獲得雙酶切產(chǎn)物的理想結(jié)果。再次，以連接產(chǎn)物為模板，其稀釋濃度的大小對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)量和效率有直接影響力［15］。擴(kuò)增條帶隨模板稀釋倍數(shù)增大而增強(qiáng)，這可能是由于過(guò)高濃度的模板使引物或dNTP提早耗盡，導(dǎo)致預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量較低的原因［16］。

循環(huán)數(shù)是影響本實(shí)驗(yàn)預(yù)擴(kuò)增結(jié)果的重要因素。眾所周知，循環(huán)數(shù)增加有利于目的片段數(shù)目增長(zhǎng)，但循環(huán)擴(kuò)增次數(shù)太多可能會(huì)導(dǎo)致非預(yù)期雜帶的比例也增大，這是由于引物非特異性結(jié)合或Taq酶活性下降所致［16］。27個(gè)循環(huán)數(shù)獲取的產(chǎn)物與較小循環(huán)數(shù)擴(kuò)增的產(chǎn)物相比，其帶型結(jié)構(gòu)基本一致但彌散帶更清亮;而30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，其帶型結(jié)構(gòu)已發(fā)生明顯變化，說(shuō)明PCR過(guò)程可能出現(xiàn)了非特性擴(kuò)增現(xiàn)象，不能應(yīng)用于后續(xù)選擇性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

與前人的研究報(bào)道不太一致［17－19］，Mg2+濃度是本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中最關(guān)鍵的影響因子。Mg2+濃度是影響PCR結(jié)果的重要變量之一，反應(yīng)中Taq堂甘荕g2+的依賴酶，對(duì)Mg2+濃度特別敏感，最佳Mg2+濃度不僅有利于酶活性提高從而增加擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率及質(zhì)量，而且對(duì)反應(yīng)特異性、引物退火、模板、PCR產(chǎn)物解鏈溫度、引物二聚體形成等均有影響［20］。實(shí)驗(yàn)體系中加入2.5μL Mg2+(25mmol/L)擴(kuò)增的產(chǎn)物，其檢測(cè)的結(jié)果明顯更好，獲得的指紋豐富程度及有價(jià)值的位點(diǎn)的比例明顯更多，是菜心PCR擴(kuò)增的最佳Mg2+(25mmol/L)用量。最后，將獲得選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)帶型清晰、分辨率高、擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度基本一致、覆蓋面廣、重復(fù)性好等，說(shuō)明優(yōu)化和建立的菜心cDNA－AFLP分析體系適用于分析并研究菜心抽薹開花轉(zhuǎn)錄組差異顯示基因，為菜心抽薹分子機(jī)制研究提供重要參考。

［1］Durrant W E，Rowland O，Piedras P，et al.cDNA －AFLP reveals a striking overlap in race－specific resistance and wound response gene expression profiles［J］.The Plant Cell，2000，12(6):963－977.

［2］郭瑩，楊曉云，張青霞，等.大白菜cDNA－AFLP分析體系的優(yōu)化［J］.分子植物育種，2010，8(5):1003－1007.

［3］蔡綿聰，李淑儀，陳真元，等.菜心氮磷鉀施肥效應(yīng)研究［J］.土壤通報(bào)，2010，41(1):126 －132.

［4］肖旭峰，曹必好，王勇，等.菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆與表達(dá)［J］.園藝學(xué)報(bào)，2008，35(6):827－832.

［5］趙麗華.石榴 AFLP 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.北方園藝，2012，21:79－82.

［6］于虹，丁國(guó)華.cDNA－AFLP技術(shù)及在差異表達(dá)基因克隆上的應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23(12):77－80.

［7］康俊根，王曉武，張國(guó)裕，等.利用cDNA－AFLP檢測(cè)甘藍(lán)雄性不育相關(guān)基因的時(shí)序性表達(dá)［J］.園藝學(xué)報(bào)，2006，33(3):544－548.

［8］王永勤，曹家樹，符慶功，等.利用cDNA－AFLP技術(shù)分析白菜核雄性不育兩用系的表達(dá)差異［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(5):557 －560.

［9］萬(wàn)翔，劉富中，宋明，等.茄子AFLP技術(shù)體系的優(yōu)化與建立［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(2):226－229.

［10］付鳳玲，李晚忱.用cDNA－AFLP技術(shù)構(gòu)建基因組轉(zhuǎn)錄圖譜［J］.分子植物育種，2003，1(4):523－529.

［11］田勝平，汪陽(yáng)東，陳益存，等.山蒼子AFLP反應(yīng)體系的建立及其引物篩選［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2012，25(2):174－181.

［12］吳智明，曾晶，胡開林，等.辣椒cDNA－AFLP體系的優(yōu)化與應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(12):26－29.

［13］唐美瓊，姚紹嫦，李林軒，等.藥用植物草珊瑚AFLP反應(yīng)體系的建立［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51(17):3879－3881.

［14］王忠，楊清，汪仁，等.野生茄子cDNA－AFLP分析體系的優(yōu)化和建立［J］.生物技術(shù)，2012，9:108－112.

［15］許錦彪，段彪，邵園元，等.水稻葉片cDNA－AFLP技術(shù)體系的建立和優(yōu)化［J］.種子，2012，31(6):33－39.

［16］黃河，王順利，曹華雯，等.甘菊 cDNA －AFLP 反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009，11:108 －113.

［17］李亞麗，沈文濤，言普，等.建立番木瓜性別研究的 cDNA－AFLP分析體系［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2009，30(4):515－519.

［18］郭彥彥，唐文煜，邢世巖，等.銀杏AFLP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3):377－381.

［19］佟廣香，匡友誼，尹家勝，等.唇螖基因組AFLP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(4):727－733.

［20］桑燕，湯青林，王志敏，等.芥菜 cDNA －AFLP 反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(4):101－105.