張敏瑩，徐東坡，段金榮，劉 凱，周彥鋒，施煒綱

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點開放實驗室，農(nóng)業(yè)部 長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，江蘇 無錫 214081)

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)又稱青蝦或河蝦，隸屬于甲殼綱，十足目，長臂蝦科，沼蝦屬。日本沼蝦是中國重要的淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類，它廣泛分布于中國淡水水域，尤以五大淡水湖泊(鄱陽湖、洞庭湖、太湖、洪澤湖和巢湖)資源分布量大。洮湖(又名長蕩湖)位于江蘇省南部、太湖流域上游，地處金壇、溧陽兩市交界處，是江蘇省十大淡水湖泊之一。洮湖日本沼蝦以個體大、生長快、品質(zhì)好等優(yōu)點而聞名，是國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)的重點保護種類。對一個特定物種或種群遺傳多樣性的了解是保護和利用這一物種或種群的基礎(chǔ)。關(guān)于日本沼蝦遺傳多樣性的研究已有不少報道［1－9］，但還未見關(guān)于洮湖日本沼蝦遺傳多樣性的報道。自2007年5月太湖藍藻暴發(fā)后，太湖流域水域污染及其治理引起廣泛關(guān)注和高度重視。目前隨著“引江濟太”工程的逐步推進，作為6大引排水工程之一的新孟河延伸拓浚工程被列為近期規(guī)劃實施工程。按照規(guī)劃，拓浚工程后洮湖將每年引進太湖水，實現(xiàn)年換水2.5次。引水是否會對洮湖漁業(yè)資源產(chǎn)生影響?引水前后洮湖日本沼蝦的遺傳多樣性是否會發(fā)生變化?這些問題目前還未見報道。

本文采集洮湖日本沼蝦樣品，運用RAPD技術(shù)和微衛(wèi)星(SSR)技術(shù)對其遺傳多樣性進行研究。初步了解洮湖日本沼蝦的遺傳多樣性現(xiàn)狀，為客觀評價新孟河延伸拓浚工程對洮湖國家水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)的影響及洮湖日本沼蝦種質(zhì)資源的保護提供本底資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

日本沼蝦樣本于2011年11月16日采自洮湖種質(zhì)資源保護區(qū)。樣品(大于1000只)采集后，直接用95%的酒精浸泡，帶回實驗室保存于4℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA制備

隨機選取日本沼蝦樣本進行總DNA提取。剪取附肢肌肉組織約100 mg，剪碎，研磨至粉末狀，放入1.5mL 的離心管中，加入450μL 的 TE 緩沖液(10mmol/LTris－HCI，pH8.0，100mmol/L EDTA，pH8.0)，再加入終濃度分別為0.5%的SDS和200 ng/μL的蛋白酶K。上述混合物于56℃消化4 h至溶液澄清透明，經(jīng)酚、氯仿抽提，冰乙醇沉淀。提取的DNA經(jīng)70%的乙醇洗滌，室溫干燥后溶于適量ddH20中，置于－20℃保存?zhèn)溆?。DNA濃度通過紫外分光光度計和電泳－EB染色的熒光強度雙重測定。

1.3 微衛(wèi)星引物及隨機引物

微衛(wèi)星引物合成參照馮建彬等［9］設(shè)計合成5對微衛(wèi)星引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。實驗共用2個系列40個隨機引物，分別為上海申能博采生物科技有限公司的A、B系列，最后篩選出17個擴增條帶清晰、重復(fù)性好的引物(表2)。

表1 本實驗所用的日本沼蝦微衛(wèi)星位點及其引物Tab.1 SSR loci and primers used in the paper of Macrobrachium nipponense

1.4 PCR反應(yīng)及電泳條件

RAPD 擴增總體積為 25μL，反應(yīng)混合物中包括 PCR Buffer2.5μL，MgCl22.0μL(25mmol/L)，基因組 DNA 1μL(20 μg/mL)，Taq DNA 聚合酶 0.2μL(5 U/μL);dNTPs 2μL(各 2.5mmol/L);引物1μL(20μmol/L);用ddH20補足25μL體積。94℃預(yù)變性3min后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃ 45 s、36℃ 45 s、72℃1min，最后于72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取擴增產(chǎn)物8μL在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分離(1×TAE，5 V/cm，約1 h)，EB染色，UV－II紫外透射分析儀上觀察和拍照。

微衛(wèi)星 PCR 反應(yīng)體系為 10μL，包括 10×buffer(含 Mg2+)1μL、2.5mmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 上下游引物各 0.35μL、5 U TaqDNA 聚合酶0.1μL、50 ng/μL 的 DNA 模板 1μL，用超純水補足10μL。PCR反應(yīng)在ABI 2720 PCR儀中進行，反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性4min;94℃變性30 s，52～61℃(根據(jù)引物的不同選擇溫度)復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán);72℃終延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，參照許紹斌等［10］快速銀染檢測，拍照保存。

1.5 RAPD數(shù)據(jù)處理

根據(jù)RAPD擴增結(jié)果，擴增條帶有且清晰記為1，否則記為0，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)表征矩陣;根據(jù)微衛(wèi)星擴增結(jié)果，依據(jù)等位基因片段長度從小到大標(biāo)為A、B、C等，并據(jù)此構(gòu)建擴增結(jié)果數(shù)據(jù)矩陣，采用軟件PopGen32對RAPD研究中多態(tài)位點比例、Shannon多樣性指數(shù)及SSR擴增中每個位點的等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)等遺傳學(xué)參數(shù)進行計算。其中，P=多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)×100%;Shannon多樣性指數(shù)(Chalmers K J et al，1992):I= －ΣPilnPi(Pi為位點i在某一群體中的出現(xiàn)頻率)，多態(tài)信息含量(PIC)參照Bostein等［11］的方法計算。

2 結(jié)果分析

2.1 RAPD 擴增結(jié)果

從40個10 bp隨機引物中篩選出17個擴增效果好的引物。17個隨機引物的擴增結(jié)果表明，15個引物為多態(tài)性引物，2個引物為單態(tài)引物。圖1為隨機引物B15對洮湖日本沼蝦的擴增電泳圖。每個引物擴增出3～8條清晰且重復(fù)性強的條帶，其片段大小在100～1000 bp之間，共計95條，其中46條帶表現(xiàn)為多態(tài)，多態(tài)位點比例為16.67% ～66.67%，平均為48.42%;遺傳雜合度H為0.1960，Shannon多樣性指數(shù)I為0.2576。17個引物的擴增情況見表2。

圖1 引物B15對洮湖日本沼蝦的RAPD擴增電泳圖(Marker為 100 bp+1.5 kb DNA ladder)Fig.1 RAPD bands by primer B15 of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake(Marker:100 bp+1.5 kb DNA ladder)

表2 洮湖日本沼蝦17個隨機引物序列及RAPD擴增結(jié)果Tab.2 Sequences and amplification results of 17 random primers of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake

2.2 SSR擴增結(jié)果

將合成的5對微衛(wèi)星引物對洮湖日本沼蝦群體(共30尾)進行擴增，5對引物均得到較好擴增，圖2為微衛(wèi)星基因座Mni03在洮湖日本沼蝦群體的擴增結(jié)果。各位點等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量如表3。在5個微衛(wèi)星基因座中，共檢測到50個等位基因，每個位點平均等位基因數(shù)為10，平均有效等位基因數(shù)為5.5474。

圖2 微衛(wèi)星基因座Mni03在洮湖日本沼蝦群體的擴增結(jié)果(M為pBR322 DNA/Msp1分子量標(biāo)準(zhǔn))Fig.2 PCR result of Mni03 locus in Taohu Lake population of Macrobrachium nipponense

5個微衛(wèi)星位點觀測雜合度為0.6621～0.8533，期望雜合度為0.6842～0.8674，多態(tài)信息含量為0.3893 ～0.7123，平均觀測雜合度為0.7425，平均期望雜合度為 0.7766，平均多態(tài)信息含量為 0.5740。在這5個位點中有3個位點表現(xiàn)為高度多態(tài)(PIC＞0.5)，2個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)。

表3 洮湖日本沼蝦群體微衛(wèi)星分析結(jié)果Tab.3 Result of SSR study of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake

3 討論

(1)郭闖等［12］采用ISSR技術(shù)對江蘇長江和太湖2個地區(qū)日本沼蝦群體的遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果顯示日本沼蝦長江和太湖兩群體的多態(tài)位點比率均為63.64%，Shannon多樣性指數(shù)分別為0.3480和0.3465;吳滟等［5］對太湖不同水域(無錫、宜興、蘇州及湖州水域)野生日本沼蝦進行了RAPD分析，結(jié)果表明四個群體的多態(tài)位點比例分別為 49.57%、60.68%、53.85%、57.26%，雜合度為 0.2077 ～0.2163，Shannon多樣性指數(shù)0.2967～0.3053;本研究RAPD擴增結(jié)果表明洮湖日本沼蝦多態(tài)位點比例為48.42%，雜合度為 0.1960，Shannon多樣性指數(shù) 0.2576，多態(tài)位點比例(48.42%)和 Shannon 多樣性指數(shù)(0.2576)略低于日本沼蝦長江群體(63.64%，0.3480)，與吳滟等對太湖日本沼蝦(無錫和蘇州水域)的研究結(jié)果類似，與其它地區(qū)野生蝦類［6－7］比較，洮湖日本沼蝦遺傳雜合度處于較高水平，群體遺傳多樣性水平較豐富，種質(zhì)資源保存較好。

馮建彬等［8］用12個微衛(wèi)星引物擴增吳江、濱湖、宜興和吳興4個太湖日本沼蝦群體，結(jié)果表明4個群體平均觀測雜合度(Ho)為 0.7500 ～0.8222，平均期望雜合度(He)為 0.8886 ～0.9149，說明太湖日本沼蝦群體具有較高遺傳多樣性，其中宜興和濱湖群體遺傳多樣性高于吳江群體。本研究SSR擴增結(jié)果表明，洮湖日本沼蝦群體的平均觀測雜合度(Ho)為0.7425，平均期望雜合度(He)為0.7766，平均期望雜合度(He=0.7766)高于泰國羅氏沼蝦(He=0.64 ～0.73)［13］，與洪澤湖日本沼蝦9個野生群體［9］的遺傳多樣性相近(He為0.6982 ～0.8044)，略低于上述太湖日本沼蝦SSR研究結(jié)果，推測是由于本研究所選微衛(wèi)星位點較少所致。

一般認(rèn)為每種分子標(biāo)記都有其局限性，因方法不同其結(jié)果有可能存在差異。本文采用2種方法對洮湖日本沼蝦群體遺傳多樣性進行了研究，結(jié)果都表明洮湖日本沼蝦群體遺傳多樣性較豐富，因此在湖區(qū)建立日本沼蝦種質(zhì)資源自然保護區(qū)，可以更好地有效保護日本沼蝦野生種質(zhì)資源。

(2)洮湖作為江蘇十大淡水湖之一，具有豐富野生日本沼蝦資源。本文對洮湖日本沼蝦野生群體的遺傳多樣性進行了分析，初步掌握了洮湖日本沼蝦的遺傳多樣性現(xiàn)狀。雖然樣本是從大量樣本(大于1000只)隨機抽取，但由于實驗樣本數(shù)不是很大，且采樣點集中于洮湖種質(zhì)資源保護區(qū)，因此所得結(jié)果可能與整個湖泊日本沼蝦遺傳多樣性的實際水平有所出入。洮湖不同湖區(qū)日本沼蝦的遺傳多樣性有待于進一步研究。

盡管本研究表明，洮湖日本沼蝦野生群體目前尚保持了較高的遺傳多樣性，但拓浚工程后洮湖將每年引進太湖水，實現(xiàn)年換水2.5次。引水導(dǎo)致的水質(zhì)、水草生長情況變化及外來種群的入侵可能導(dǎo)致遺傳多樣性的降低及種質(zhì)混雜。因此，應(yīng)采用多種分子標(biāo)記技術(shù)，對洮湖日本沼蝦的遺傳多樣性進行系統(tǒng)的跟蹤監(jiān)測，全面了解其遺傳多樣性水平及變化規(guī)律，進而指導(dǎo)洮湖日本沼蝦種質(zhì)資源的保護和利用。

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