熊冬梅，蘇小軍，熊興耀，2

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；2．中國(guó)農(nóng)科院蔬菜花卉研究所，北京100081）

蓖麻毒蛋白來(lái)源于大戟科植物蓖麻，在蓖麻籽中的含量為1%～5%［1］。蓖麻毒蛋白由兩條肽鏈組成，屬于二型核糖體失活蛋白，具有天然植物毒素典型的半毒素結(jié)構(gòu)及強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，從而造就了蓖麻毒蛋白的雙面性，一方面賦予它在醫(yī)學(xué)抗癌、生物農(nóng)藥、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理研究等方面的潛在作用和優(yōu)勢(shì)；另一方面因難以察覺(jué)且快速致命的強(qiáng)烈毒性使其成為恐怖襲擊者的武器，威脅人類(lèi)生命安全。隨著蓖麻毒蛋白在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、軍事防控等領(lǐng)域應(yīng)用的拓展，研究者們對(duì)高純度、高活性的蓖麻毒蛋白的需求進(jìn)一步增多，因此獲得高效提取蓖麻毒蛋白的方法具有重要意義。

1 蓖麻毒蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

蓖麻毒蛋白為無(wú)味白色粉末或結(jié)晶型固體，不溶于有機(jī)溶劑，易溶于稀酸或鹽類(lèi)水溶液，能在飽和硫酸銨溶液中沉淀析出，對(duì)熱、酸、堿比較穩(wěn)定，干熱處理不易變性［2］。

蓖麻毒蛋白是由效應(yīng)鏈RTA和結(jié)合鏈RTB經(jīng)二硫鍵結(jié)合而成的異源二聚體植物蛋白毒素，RTA由263個(gè)氨基酸殘基組成，分子量32 000；RTB由259個(gè)氨基酸殘基組成，分子量34 000。

蓖麻毒蛋白的作用機(jī)理是由RTB利用乳糖結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞表面糖脂或糖蛋白受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞吞噬作用將RTA攜帶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，毒蛋白分子被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體后逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），在ER內(nèi)被蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶解離，游離出有催化活性的RTA，RTA 再 通 過(guò) ERAD（ER－Associated protein degradation）途徑進(jìn)入胞漿催化核糖體28SrRNA脫去腺嘌呤，從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。

2 蓖麻毒蛋白的提取方法

不同提取方法獲取的蓖麻毒蛋白在純度、質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等方面不同，因此提取方法直接影響著蓖麻毒蛋白的研究方向和用途。

2．1 物理化學(xué)法

物理化學(xué)法提取蓖麻毒蛋白的主要步驟是物理研磨、鹽析、透析獲取粗蛋白，然后利用親和層析法進(jìn)行蛋白的分離純化。代表性的物理化學(xué)提取法是Nicolson和Blaustein的方法［4］，即磷酸緩沖溶液法粗提和瓊脂糖凝膠親和層析法分離純化蓖麻毒蛋白。

2．1．1 蓖麻粗毒蛋白的制備

目前蓖麻粗毒蛋白的制備主要有磷酸緩沖溶液提取法和稀酸提取法。一般的步驟為：取一定量脫殼蓖麻籽勻漿后用磷酸緩沖溶液或稀酸于4℃浸泡16h；四層紗布過(guò)濾，取上清液離心20min，棄沉淀及上層脂肪；獲得的液體用60%飽和硫酸銨溶液于4℃浸泡過(guò)夜，離心20min；取沉淀用磷酸緩沖溶液或稀酸進(jìn)行透析，透析完成后用PEG6000覆蓋脫水或真空冷凍干燥透析液，最終獲得蓖麻粗毒蛋白。蓖麻粗毒蛋白的雜質(zhì)越少，越利于后期的分離純化。

為提高粗毒蛋白提取率，研究者對(duì)蓖麻粗毒蛋白制備方法做了改進(jìn)。陳祥勝等［5］認(rèn)為蓖麻籽勻漿中的脂肪對(duì)蛋白有較強(qiáng)阻隔作用，易導(dǎo)致蛋白不能充分提取，因此在提取前將蓖麻籽的勻漿進(jìn)行脫脂，有效地提高了蛋白質(zhì)的提取率，并發(fā)現(xiàn)磷酸緩沖溶液處理的粗毒蛋白產(chǎn)率明顯高于稀酸提取法。王瑩等［6］對(duì)蓖麻毒蛋白提取過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，用勻漿冰浴研磨及高速冷凍離心替代常溫研磨及四層紗布過(guò)濾、用4℃下聚乙二醇包埋2～3h替代透析過(guò)夜，有效地縮短了提取時(shí)間并取得較好的效果。

2．1．2 蓖麻毒蛋白的分離純化

蓖麻粗毒蛋白中包含蓖麻毒蛋白、蓖麻凝集素、脂肪及其它一些未能除盡的蛋白和雜質(zhì)，其中蓖麻毒蛋白和蓖麻凝集素具有相似性。蓖麻毒蛋白的常用分離純化方法是親和層析法。在獲得蓖麻粗毒蛋白后，先采用Sepharose 4B柱將粗毒蛋白中蓖麻毒蛋白及蓖麻凝集素吸附在柱上，再利用RTB對(duì)半乳糖的特殊親和能力，用含0～0．2mol·L－1D－半乳糖的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，然后用Sephadex G－100／200凝膠過(guò)濾層析，緩沖溶液洗脫，收集純化的蓖麻毒蛋白。用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法檢測(cè)蓖麻毒蛋白純度。

隨著研究工作中對(duì)蓖麻毒蛋白純度及活性效價(jià)要求的提高，分離純化方法也在不斷地被改進(jìn)。Simmons等［7］將半乳糖與Sepharose 4B共價(jià)偶聯(lián)，通過(guò)梯度洗脫一步分離蓖麻毒蛋白。張振范等［8］提出直接利用0．2mol·L－1D－半乳糖洗脫Sepharose 4B柱上的蓖麻毒蛋白可將分離純化過(guò)程直接簡(jiǎn)化為一步，無(wú)需另行合成親和膠，從而節(jié)省了時(shí)間，也促進(jìn)了蓖麻毒蛋白的大規(guī)模純化。余濤等［9］將p－苯胺基－1－巰基－β－D－吡喃半乳糖苷瓊脂糖凝膠作為親和層析介質(zhì)并結(jié)合Sephcaryl S－200凝膠介質(zhì)，通過(guò)兩步層析純化大大提高了蓖麻毒蛋白的純度。

2．1．3 RTA、RTB的分離純化

基于更深入研究的需要，須將RTA、RTB進(jìn)行分離。由于RTA與RTB的分子量相近，凝膠層析法難以將兩者分離，因此，利用RTB具有半乳糖結(jié)合位點(diǎn)的特點(diǎn)，將純化的蓖麻毒蛋白樣品加樣于Sepharose 4B柱，加入1BV的5%巰基乙醇封柱12h，用含5%巰基乙醇的Tris－HCl緩沖溶液洗脫得到含有少量RTB的RTA 粗品，用含0．2mol·L－1D－半乳糖的Tris－HCl緩沖溶液洗脫得到RTB粗品。將粗品上樣DEAE 52柱一步純化，由于RTA的等電點(diǎn)為7．6、RTB的等電點(diǎn)為5．5，用pH值為8．5的含5%巰基乙醇的0．1mol·L－1的 Tris－HCl緩沖溶液洗脫得到RTA純品，用pH 值為8．5的含0．15mol·L－1NaCl及5%巰基乙醇的0．1mol·L－1的 Tris－HCl緩沖溶液洗脫得到 RTB純品［10，11］。

2．2 生物制備法

生物制備法主要是通過(guò)基因載體向適合的受體細(xì)胞導(dǎo)入目的基因，構(gòu)建具有高效表達(dá)目的產(chǎn)物能力的基因工程菌或植物，即基因工程技術(shù)表達(dá)法。受體細(xì)胞可以是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。目的基因可以是RTA或RTB基因，也可以是RTA與其它功能性蛋白基因的整合或RTB與其它功能性蛋白基因的整合。因此，表達(dá)的產(chǎn)物可以是修飾或未修飾過(guò)的RTA或RTB蛋白、RTA融合蛋白、RTB融合蛋白。

目前生物制備法獲取和研究蓖麻毒蛋白已成為熱點(diǎn)。裴武紅等［12］根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源模建及表觀靜電勢(shì)分析，設(shè)計(jì)并擴(kuò)增RTA突變體基因，通過(guò)pKK223－3載體導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得RTA的高效、可溶性表達(dá)，并檢測(cè)到預(yù)期的生物學(xué)活性。王洪斌等［13］通過(guò)基因工程菌表達(dá)分別獲得去除高度糖基化的RTA和RTB，并利用RTB介導(dǎo)RTA進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。Carter等［14］為增強(qiáng)對(duì)Ⅰ型糖尿病自身免疫疾病的抑制，利用基因工程手段將非特異性細(xì)胞表面受體蓖麻毒素（RTB）基因與編碼區(qū)域的前胰島素基因（INS）整合導(dǎo)入馬鈴薯基因，最終獲得的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯能表達(dá)融合蛋白（INS－RTB），在動(dòng)物口服試驗(yàn)中表現(xiàn)出抑制疾病的作用。Choi等［15］通過(guò)將輪狀病毒SA11外衣殼糖蛋白（VP7）的編碼基因與RTB基因整合并轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組進(jìn)行表達(dá)，獲得了具有增強(qiáng)免疫力作用的VP7－RTB融合蛋白。

3 蓖麻毒蛋白的應(yīng)用研究

近年來(lái)，蓖麻毒蛋白在生物農(nóng)藥、醫(yī)學(xué)抗癌、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)理研究、生物防恐等領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛的研究。

蓖麻毒蛋白作為毒性最強(qiáng)的植物源毒素之一，同時(shí)具備了植物毒素在環(huán)境中自然降解、無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)，適用于生物農(nóng)藥的研發(fā)，目前國(guó)內(nèi)這方面的研究較多，多面向于蟲(chóng)鼠災(zāi)害。金汝城等［16］發(fā)現(xiàn)直接分離純化的植物源蓖麻毒蛋白有較好的南方根結(jié)線蟲(chóng)殺滅效果。孫媚華等［17］在改進(jìn)脫脂方法提取的蓖麻粗毒蛋白中添加粘米粉、糯米粉和葡萄糖等餌料，提高了鼠藥的適口性，減少了小鼠的拒食行為，增強(qiáng)了滅鼠效果。

蓖麻毒蛋白在醫(yī)學(xué)方面的研究大多集中于功能性融合蛋白的研制，包括免疫毒素、免疫融合蛋白［14］、抗原性融合蛋白［15］等，目前國(guó)外新出現(xiàn)的口服型植物源免疫融合蛋白的研制即是針對(duì)免疫疾病來(lái)進(jìn)行的?；赗TA、RTB的不同功能特征，RTA主要用于發(fā)揮毒素效應(yīng)，因此常與具備特異性結(jié)合能力的蛋白整合，用于抗腫瘤單克隆抗體的制備［18］。RTB對(duì)受體細(xì)胞具有非特異性結(jié)合性能，常與一些功能性蛋白進(jìn)行整合獲得相應(yīng)功能的單克隆抗體，如將RTB與作用于橫紋肌的煙酸型乙酰膽堿受體蛋白整合獲得RTB－mAb35單克隆抗體，有助于治療斜視［19］、制備增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的抗原性融合蛋白［20］等。

由于RTB非特異結(jié)合細(xì)胞的能力，常用于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理方面的研究，既可單獨(dú)研究蓖麻毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)理［21］，也可通過(guò)RTB將功能性融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)以便研究功能蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)理［22］。

蓖麻毒蛋白用于生物防恐的研究主要是兩個(gè)方面，一方面是蓖麻毒蛋白檢測(cè)方法的研究，另一方面是蓖麻毒蛋白中毒的治療及疫苗制備。目前已建立了多種快速、靈敏、特異的蓖麻毒蛋白檢測(cè)方法，如依據(jù)毒素的蛋白免疫原性而建立的免疫學(xué)分析法和生物傳感器法；依據(jù)毒素的組成等建立的儀器－化學(xué)分析法［23］，而多種方法的同步檢測(cè)更能提高檢測(cè)的精確度。蓖麻毒蛋白在預(yù)防治療方面主要涉及拮抗劑的制備和疫苗的研制。目前蓖麻毒蛋白拮抗劑的研究主要集中在中和性抗體、抗RTA適配體、小分子拮抗肽等方面，疫苗的研究集中在抗獨(dú)特型疫苗、重組疫苗、超級(jí)疫苗、微球疫苗等方面［24］。

4 結(jié)語(yǔ)

雖然傳統(tǒng)的物理化學(xué)提取法和新興的生物制備法均能獲取蓖麻毒蛋白，但相比之下，生物制備法能為蓖麻毒蛋白的應(yīng)用和發(fā)展提供更多的可能性。生物制備法獲取蓖麻毒蛋白的優(yōu)勢(shì)：（1）一旦獲得具有高效表達(dá)能力的基因工程菌，可省略繁雜的粗毒蛋白提取步驟；（2）直接通過(guò)生物表達(dá)可分別自由獲取蓖麻毒蛋白A鏈或B鏈，有效地防止研究中A、B鏈的相互干擾，避免植物源蓖麻毒蛋白A、B鏈協(xié)作造成的毒害作用，也可免除高度糖基化的RTB對(duì)RTA毒性作用的發(fā)揮［25］；（3）靈活多變的設(shè)計(jì)和改造目的基因，表達(dá)后獲得具有特殊功能的目的產(chǎn)物，如刪除RTA部分無(wú)用的核苷酸序列基因，使目的產(chǎn)物分子質(zhì)量降低便于進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，將非特異性運(yùn)輸鏈RTA基因或毒性鏈RTB基因與相應(yīng)功能蛋白基因片段整合，最終表達(dá)獲得各種功能性融合蛋白。

蓖麻毒蛋白的提取方法對(duì)其應(yīng)用有直接的影響，如蓖麻粗毒蛋白雖含有雜質(zhì)但已具備較強(qiáng)的毒性，可直接用于生物農(nóng)藥的研制［16，26］；細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究主要涉及蓖麻毒蛋白的具有跨膜作用的運(yùn)輸鏈RTB；腫瘤導(dǎo)向藥物——蓖麻毒素單克隆抗體制備的主要研究對(duì)象是蓖麻毒蛋白毒性鏈RTA等［18］。隨著蓖麻毒蛋白提取方法的不斷改進(jìn)和更新，蓖麻毒蛋白在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究及發(fā)展也獲得了更多的便利性和可能性。

［1］賈超．蓖麻毒蛋白生物學(xué)活性及其應(yīng)用研究［D］．蘭州：蘭州理工大學(xué)，2008．

［2］鄒立波，詹金彪．蓖麻毒素與腫瘤治療［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2001，22（6）：290－292．

［3］葛利萍，詹金彪．蓖麻毒素在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究進(jìn)展［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2003，32（6）：538－542．

［4］Nicolson G L，Blaustein J，Etzler M E．Characterization of two plant lectins from Ricinus communis and their quantitative interaction with a murine Lynpoma［J］．Biochemistry，1974，13（1）：196－204．

［5］陳祥勝，吳戎，楊哲，等．蓖麻毒蛋白提取工藝比較研究［J］．湖北中醫(yī)雜志，2013，35（4）：70－71．

［6］王瑩，黃鳳蘭，陳永勝，等．蓖麻毒蛋白提取過(guò)程條件優(yōu)化［J］．內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，25（1）：34－37，53．

［7］Simmons B M，Russell H H．A single affinity column step method for the purification of ricin toxin from castor beans（Ricinus communis）［J］．Analytical Biochemistry，1985，146（1）：206－210．

［8］張振范，應(yīng)文斌，王慶誠(chéng)．用瓊脂糖親和層析一步純化蓖麻毒蛋白［J］．生物化學(xué)雜志，1989，5（6）：486－490．

［9］余濤，唐吉軍，郝蘭群，等．一種純化蓖麻毒素的新方法［J］．生物技術(shù)，2005，15（5）：53－55．

［10］黎維勇，方凱，宋波，等．聚乙二醇修飾的蓖麻毒蛋白A鏈免疫原性與毒性的研究［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（13）：1026－1028．

［11］Fulton R J，Blakey D C，Knowles P P，et al．Purification of ricin A1，A2，and B chains and characterization of their toxicity［J］．Journal of Biological Chem，1986，261（12）：5314－5319．

［12］裴武紅，馮健男，雷紅星，等．蓖麻毒素A鏈突變體的設(shè)計(jì)、表達(dá)與活性研究［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999，26（3）：270－272，294．

［13］王洪斌，董丹，許冰，等．蓖麻毒素A鏈基因的克隆表達(dá)、純化及其活性［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（1）：145－149．

［14］Carter J E，Odumosu O，Langridge W H R．Expression of a ricin toxin B subunit：Insulin fusion protein in edible plant tissues［J］．Mol Biotechnol，2010，44（2）：90－100．

［15］Choi N W，Estes M K，Langridge W H R．Synthesis of a ricin toxin B subunit－rotavirus VP7fusion protein in potato［J］．Molecular Biotechnology，2006，32（2）：117－128．

［16］金汝城，賈超，楊曉華，等．蓖麻毒蛋白的分離純化及其對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)殺滅效果的研究［J］．中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2008，3（4）：293－296．

［17］孫媚華，陳遷，宋光泉，等．基于蓖麻毒蛋白生物鼠藥的制備及其殺鼠效果研究［J］．中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2011，22（3）：218－222．

［18］申蘇建，吳金明，金思思，等．蓖麻毒蛋白A鏈與抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體偶聯(lián)物的抗腫瘤效應(yīng)［J］．中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（11）：1234－1239．

［19］Christiansen S P，朱玉廣．蓖麻毒蛋白－mAb35對(duì)兔眼外肌的長(zhǎng)期作用：可能的斜視治療方法［J］．國(guó)外醫(yī)學(xué)：眼科學(xué)分冊(cè)，2003，27（2）：126－127．

［20］Donayre－Torres A J，Esquivel－Soto E，Gutiérrez－Xicoténcatl M L，et al．Production and purification of immunologically active core protein p24from HIV－1fused to ricin toxin B subunit in E．coli［J］．Virology Journal，2009，6：17．

［21］陳欣虹，劉瓊，詹金彪．蓖麻毒素A鏈與綠色熒光蛋白基因的融合表達(dá)和活性測(cè)定［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，34（3）：201－206．

［22］李能章，潘國(guó)慶，李田，等．家蠶微孢子蟲(chóng)蓖麻毒蛋白B鏈基因RBL463－4的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)［J］．蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（6）：957－961．

［23］全燦，劉軍．納米顆粒探針檢測(cè)核糖體失活蛋白［J］．分析化學(xué)，2010，38（5）：627－631．

［24］郭建巍，沈倍奮．蓖麻毒素拮抗劑及疫苗研究概況［J］．國(guó)際免疫學(xué)雜志，2006，29（4）：217－220．

［25］Lord J M，Roberts L M，Robertus J D．Ricin：Structure，mode of action，and some current applications［J］．FASEB J，1994，8（2）：201－208．

［26］何耀宏，高杉，周俗，等．植物滅鼠劑在青藏高原防治高原鼠兔應(yīng)用試驗(yàn)［J］．四川動(dòng)物，2006，25（4）：743－746．