徐寧 ，辛嘉英 ,，王艷 ，董靜 ，夏春谷

1.哈爾濱商業(yè)大學 省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；

2.中國科學院蘭州化學物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

加氧酶是一類能高效而專一地催化分子氧摻入各種有機化合物的酶，根據(jù)加氧方式的不同，可分為單加氧酶和雙加氧酶[1]。甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO，EC.1.14.13.25，）是單加氧酶中非常重要的一種酶，可以將分子氧中的一個氧原子插入極穩(wěn)定的甲烷分子的碳氫鍵中，另一個氧原子則還原成水[2]。因此，對于以甲烷為惟一碳源生長的甲烷氧化細菌而言，MMO在分子氧的作用下催化甲烷氧化成甲醇，而成為甲烷氧化細菌代謝過程中的重要酶系[3]。甲烷氧化細菌代謝途徑中甲烷氧化的過程可參閱文獻[4]。

由于上述反應，甲烷氧化細菌能生物性轉化大氣中日益增加的溫室氣體甲烷，從而有助于緩解溫室效應[5]。此外，甲烷氧化細菌通過MMO氧化甲烷釋放出的有機物可以作為污水脫氮過程中的電子供體，以解決城市污水處理問題[6]。除了催化甲烷進行單加氧反應外，MMO還可以將氧原子插入其他烴類的碳氫鍵中[7]，MMO催化烯烴生成的環(huán)氧化合物是化學合成制藥工業(yè)的重要中間體，催化鹵代烴類和芳香烴類在環(huán)境污染的控制中具有潛在應用價值，如甲烷氧化細菌中的MMO可以催化三氯乙烯生成三氯乙醛，進而被甲烷氧化細菌進一步氧化成酸性產物，達到降解三氯乙烯消除環(huán)境污染的目的[8]。

MMO優(yōu)越的催化性質使其受到了極大的關注，關于其結構組成、催化機理、應用前景等方面的研究也成為目前的研究熱點。

1 MMO的組成與結構

MMO是一類含有雙核鐵活性中心的非血紅素蛋白酶，可從6種不同的能氧化甲烷的細菌（Methy?losinus trichosporium，Methylococcus capsulatus，Meth?ylosinus sporium，Methylocystis sp.MM1，Methylomo?nas methanica 68-1，Methylobacterium sp.CRL-26）中提取到無細胞的具有MMO活性的制劑[9]。已知MMO有2種類型：一種是分泌在周質空間中的可溶性MMO（soluble MMO，sMMO），存在于大部分甲烷氧化細菌中；另一種是與細胞膜結合的顆粒性MMO（particulate MMO，pMMO），存在于除Methylocella以外的已發(fā)現(xiàn)的所有甲烷氧化細菌中。2種類型MMO的結構都比較復雜，都含有多個亞基和輔助因子，但它們在催化底物特異性上存在差異：pMMO的底物范圍相對較窄，只能氧化C1～C4的烴類和烯烴；相反地，sMMO催化的底物范圍更廣，包括C5～C9的烴類、烯烴、芳香族化合物和鹵代烴等。

1.1 sMMO的結構

來源于Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methy?losinus trichosporium OB3b的sMMO被廣泛研究。sMMO是一種含鐵的非血紅素酶，由3個組分構成，分別是羥基化酶（MMOH）、蛋白調節(jié)酶（MMOB）和還原酶（MMOR）。MMOH是由3個亞基組成的二聚體α2β2γ2，3 個亞基的相對分子質量（Mr）分別為 60×103、45×103和 20×103。每個α亞基含有一個非血紅素和一個羥基橋連接的雙核鐵中心，在這個中心甲烷和氧氣相互作用形成甲醇，這是酶的活性中心，這種晶體結構已被證實[10]。MMOH的α亞基和β亞基間存在一條通道，該通道下面約12?處是雙核鐵中心。MMOB的Mr為16×103，其活性可由其N端的水解進行調節(jié)，其作用是調節(jié)還原酶和羥化酶的電子傳遞過程。第3個組分MMOR的Mr是39×103，接受來自NADH2的電子，通過［2Fe-2S］和FAD輔因子，將其傳遞給MMOH的雙核鐵中心活性位點。

天然狀態(tài)下，MMOH中的雙核鐵中心處于氧化態(tài)，即2個三價鐵離子Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ），這2個Fe（Ⅲ）通過由一個羥基、一個谷氨酸和一個水分子的外源橋構成的三重橋彼此連接，此時氧化態(tài)的MMOH沒有活性。在催化性循環(huán)中，這個雙核鐵中心首先被還原為混合態(tài)即Fe（Ⅲ）Fe（Ⅱ），開始表現(xiàn)MMO活性，當MMOH進一步被還原時，雙核鐵中心就被還原為還原態(tài)的2個二價鐵離子Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），二者是以μ-O連接的[11]，活性明顯增加，電子通過還原酶從NADH轉移到MMOH上。每個鐵原子都有6個配位子，1個配位了來自組氨酸的氮原子，5個配位來自谷氨酸殘基、羧基、羥基和水分子的氧原子，雙核鐵中心通過氫鍵將Thr213陷入這個酶活性腔內。氧化狀態(tài)的雙核鐵中心可以改變它的外源性配位子的連接和形狀，這個特性對催化性循環(huán)中的sMMO而言非常重要，在催化性循環(huán)狀態(tài)下發(fā)生了羧化物轉化，氫氧化物離子平移并且打開配位點與氧氣發(fā)生反應，形成雙鐵過氧化物中間物[12]。氧化態(tài)和還原態(tài)MMOH的結構模型已被證實[13]。

1.2 pMMO的結構

目前，對sMMO的結構和催化機制的研究較多，特別是其結構中的氧橋連接的雙核鐵中心，而對pMMO結構模型的研究相對較少。

2005年，對從Methylococcus capsulatus（Bath）中分離到的pMMO的X線結構的研究，標志著pMMO結構研究上的一次突破[14]。pMMO是由3個亞基構成的三聚體結構，pmoA、pmoB和pmoC等3個亞基暴露于反式膜區(qū)域上部，組成了一個α環(huán)。之前的研究沒有預測出這個三聚體結構，通過電子顯微鏡觀測到了pMMO的形狀和容積，證明了其與三聚體結構的生物學關聯(lián)性[15]。

在上述pMMO的晶體結構中存在3個金屬位點，一個金屬位點是單核銅離子，位于膜上25.5?處，該銅離子配位了2個組氨酸His48和His72，其中His48殘基并不保守，這個位置多為天冬酰胺殘基，而組氨酸則由谷氨酰胺替代，而His72存在于許多pmoB中，相應的位置是精氨酸，但這個結構并不是完全保守的。第二個金屬位點是鋅離子，存在于反式膜區(qū)域（鋅這個位點可能是偶發(fā)的，因為結晶介質需要這種金屬，在純化的pMMO中不含有鋅），該鋅離子被pmoC上的Asp156、His160和His173以及pmoA上的Glu195配位，這4個殘基堅固。還有一個金屬位點是雙核銅離子簇，2個銅離子的間距為2.6?，其中一個銅離子連接了2個組氨酸（His137和His139）咪唑，另一個銅離子連接了一個咪唑以及pmoB亞基的N端[16]。

與上述從Methylococcus capsulatus（Bath）中分離的pMMO的晶體結構不同，從Methylosinus trichospo?rium OB3b中分離到的pMMO的晶體結構中缺少單核銅離子位點，而且鋅離子也被銅離子取代[17]。雙核中心通過與其他殘基結合而被牢牢固定[18]。

2 MMO的催化機理

2.1 MMO的電子轉移

甲烷氧化細菌通過sMMO催化NADH和O2配對將甲烷轉化為甲醇：

NAD（P）H+H++CH4+O2→ NAD（P）++CH3OH+H2O

在sMMO的結構中，MMOH是活性中心，MMOB緊密地連接在α亞基的MMOH上，MMOR中的電子轉移次序是NADH→FAD→FeS→受體，在這個途徑中，被NADH還原的FAD（位于MMOR）把電子傳遞至FeS中心，這一中心再把電子直接傳遞給MMOH中的FeFe中心，但該過程中沒有底物氧化作用發(fā)生，也沒有MMOB的參與[9]。被還原的MMOH要與被氧化的底物結合，在MMOB的存在下即能實現(xiàn)氧化作用，MMOB起作用的部位尚不清楚，但其在甲烷氧化細菌氧化甲烷的過程中是必要的。

2.2 MMO的催化機理

MMOH是sMMO的活性中心，特別是其雙核鐵中心是MMO的催化活性單元。甲烷氧化細菌氧化甲烷的催化反應中，氧化狀態(tài)的雙核鐵中心Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ）首先接受來自NADH的2個電子成為還原態(tài)Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），然后還原態(tài)的雙核鐵中心與氧分子發(fā)生反應，經(jīng)過2個中間體O和P，最終形成Fe（Ⅳ）雙核鐵簇Q，中間體Q與底物分子結合，進一步形成中間體R和T，釋放出產物并重新回到MMOH的氧化狀態(tài)。O、P、Q、R、T指的是催化循環(huán)過程中不連續(xù)的中間體，這些中間體在催化循環(huán)中扮演著很重要的角色[19]。

2.3 MMO的基因表達

2.3.1 sMMO的基因結構 目前研究較深入的是Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methylosinus trichosporium OB3b的sMMO基因。mmoX、mmoY、mmoZ分別編碼MMOH中的α、β、γ亞基，mmoB和mmoC編碼MMOB，有趣的是，mmoB位于mmoY和mmoZ之間。ORF（指的是orfY）的功能尚未知，它的編碼容量是 12×103，位于 mmoZ 和 mmoC 之間[20]。sMMO基因簇的3個主要轉錄子為：①mmoX；②mmoY，mmoB，mmoZ；③mmoY，mmoB，mmoZ，orfY，mmoC。

2.3.2 pMMO的基因結構 從Methylococcus capsu?latus（Bath）分離的pMMO，其基因簇按照pmoCAB排列，其中pmoB編碼45×103的α亞基，pmoA編碼26×103的β亞基，pmoC編碼23×103的γ亞基[20]。

2.3.3 MMO的基因調控 Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosporium OB3b既能產生sMMO又能產生pMMO，二者的表達受銅離子濃度的調控。當銅離子濃度低時sMMO表達，銅離子濃度高時pMMO表達而sMMO不表達。

該表達模式假設存在調節(jié)器抑制物R、活性劑和銅結合調節(jié)器CBR、pmo操縱子的σ70啟動子。銅離子濃度高時，CBR和銅離子結合，構形發(fā)生變化，CBA還和R、A結合在一起，這樣，阻止了R抑制pmo基因，阻止A激活smo基因，因此pMMO表達。銅離子濃度低時，CBR不能和R或A形成復合物，這樣R就能抑制smo基因的轉錄，A就能夠激活smo基因，促使連接在RNA聚合酶上的σ54開始轉錄[20]；亦或者是結合的銅離子可能直接改變R和A的構形，從而改變它們與操縱子的親和力。

3 MMO的活性

3.1 銅離子對MMO活性的影響

辛嘉英等[21]從Methylosinustrichosporium IMV3011的膜中分離純化出pMMO，發(fā)現(xiàn)銅離子濃度對純化的pMMO有激活作用，對苯二酚能夠作為pMMO有效的電子供體。van der Ha等發(fā)現(xiàn)[22]銅離子含量的增加對sMMO活性的增加沒有影響，當銅離子的濃度達到0.64 mg/L時，對sMMO有抑制作用但對pMMO的活性有促進作用。sMMO和pMMO對NaCl保持不同的活性，這可能不是二者本身的性質導致的，而是由于二者位于甲烷氧化細菌中的不同位置導致的，pMMO嵌在細胞膜內部，細胞膜上的蛋白質會緩解鹽濃度的增加，而sMMO在細胞質中因而缺少滲透性蛋白質的保護，但是目前沒有相關的研究報道。

3.2 其他物質對MMO活性的影響

Yu等[23]用甲醇代替甲烷作為甲烷氧化細菌生長的碳源，烯丙硫脲雖然可以抑制pMMO的活性，但Methylosinus trichosporium OB3b仍然保持生長，sMMO的活性也不受影響。Miyaji等[4]的研究表明，過氧化氫酶可以增加pMMO的活性，H2O2可以作為pMMO的電子供體，產生的H2O2抑制了pMMO的活性。

4 結語

之前的30年間對MMO進行了一系列的研究，通過對其晶體結構的測定，在聚集體結構、金屬中心的排列等方面取得了讓人驚喜的進展，但還有很多方面仍然是未知的，例如MMO催化過程中的中間體P*、Q和H的結構究竟是什么樣的、是什么構成了Q這樣一個蛋白催化劑、為什么pMMO的結構是三聚體、為什么這個三聚體在中心處有一個開口等。

雖然有很多問題有待解決，但分光鏡和高分辨率結晶學等手段的應用和發(fā)展，以及同位素效應實驗、X線、量子力學的使用，為解決這些難題提供了有力的技術支持。對MMO很多方面的研究還處在初級階段，未來應著重探討MMO蛋白合成體的結構、pMMO催化甲烷氧化的關鍵步驟、sMMO的分子生物學特性，以及pMMO金屬中心的生物學特性及其高活性的催化機制等方面。

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