盧艷敏

（1.衡水學(xué)院生命科學(xué)系，衡水 053000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

納米（nm）是一種長度單位，1 nm=10-9m。納米顆粒是指尺寸在0.1 nm-100 nm的超微粒子，由它們作為基本單元組成的材料稱為納米材料。納米技術(shù)（nanotechnology）概念起源于物理學(xué)家R.Feynman，是研究納米材料性質(zhì)和應(yīng)用的技術(shù)，它直接操縱單個(gè)原子、分子，用單個(gè)原子、分子制造物質(zhì)，并研究其運(yùn)動(dòng)規(guī)律及特性的技術(shù)［1，2］。納米生物技術(shù)是在納米水平上研究生命現(xiàn)象的技術(shù)，它是納米技術(shù)和生物學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，研究內(nèi)容包括：利用新興的納米技術(shù)來研究和解決生物學(xué)問題，利用生物大分子制造分子器件、模仿和制造類似生物大分子的分子機(jī)器。細(xì)胞的尺寸為微米量級(jí)，生物大分子的尺寸為納米量級(jí)，納米微粒的尺寸一般比生物體內(nèi)的細(xì)胞小得多，這為生物學(xué)研究提供了一個(gè)新的途徑［3］。目前，納米技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，主要應(yīng)用于藥物的定向運(yùn)輸與可控釋放［4-6］，細(xì)胞與核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的富集和分離［7］，單個(gè)活體細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)［8-11］，作為基因載體用于基因治療等［12，13］。

1 納米材料的性質(zhì)

1.1 表面效應(yīng)

表面效應(yīng)是指隨著顆粒粒徑的變小其比表面積急劇增大，從而使納米顆粒的表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比顯著增大，導(dǎo)致表面原子的配位數(shù)不足，有許多懸空鍵，具有不飽和性和高的表面能，使納米顆粒表面原子變得極其不穩(wěn)定，易于與其他原子相結(jié)合而穩(wěn)定下來，因此納米粒子表現(xiàn)出很高的化學(xué)活性［14］。

1.2 小尺寸效應(yīng)

小尺寸效應(yīng)是指當(dāng)顆粒的尺寸與光波的波長、電子的德布羅意波長以及超導(dǎo)態(tài)的相干長度或透射深度等物理特征尺寸相當(dāng)或更小時(shí)，晶體周期性的邊界條件將被破壞，納米粒子表面原子密度減少，導(dǎo)致顆粒宏觀物理性質(zhì)發(fā)生變化，呈現(xiàn)特殊的光學(xué)性質(zhì)、熱學(xué)性質(zhì)、磁學(xué)性質(zhì)、力學(xué)性質(zhì)及電學(xué)性質(zhì)。

1.3 宏觀量子隧道效應(yīng)

當(dāng)微觀粒子的總能量小于勢(shì)壘高度時(shí)，該粒子仍能穿越這一勢(shì)壘。微觀粒子具有的這種貫穿勢(shì)壘的能力稱為隧道效應(yīng)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)納米粒子的一些宏觀量，如納米顆粒的磁化強(qiáng)度，量子相干器件中的磁通量及電荷等也有隧道效應(yīng)，它們可以穿越宏觀系統(tǒng)的勢(shì)壘而發(fā)生變化，因此稱為宏觀的量子隧道效應(yīng)［15］。

1.4 量子尺寸效應(yīng)

量子尺寸效應(yīng)是指當(dāng)顆粒尺寸下降到某一值時(shí)，費(fèi)米能級(jí)附近的電子能級(jí)由準(zhǔn)連續(xù)能級(jí)變?yōu)殡x散能級(jí)的現(xiàn)象［16］。當(dāng)熱能、磁能、靜磁能、靜電能、光子能量或超導(dǎo)態(tài)的凝聚能比能級(jí)間距還小時(shí)，會(huì)導(dǎo)致納米顆粒的磁、光、聲、熱、電，以及超導(dǎo)電性與宏觀物質(zhì)截然不同［17］，如導(dǎo)電的金屬在顆粒尺寸下降到某一值時(shí)會(huì)變成絕緣體。

2 納米基因載體的特點(diǎn)

理想的基因載體要具有高安全性和低免疫原性，能夠保護(hù)DNA不被核酸酶降解，可以運(yùn)載不同大小的基因片段。選用高效、安全的基因載體是基因治療的一個(gè)關(guān)鍵問題，病毒載體是基因治療中較為常用的DNA運(yùn)載工具［18］，其運(yùn)載效率高，但該系統(tǒng)具有免疫原性和病毒性，裝載容量有限等缺點(diǎn)，限制了病毒載體的廣泛使用［19］。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體［20］，陽離子多聚體［21-25］和納米顆粒［26］，它們具有高的安全性、良好的生物相容性、易于生產(chǎn)、可以運(yùn)載不同大小的DNA片段，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解作用等優(yōu)點(diǎn)［27-29］。因此，非病毒載體的研究日益受到人們的重視。隨著納米技術(shù)的興起，納米顆粒作為非病毒載體在基因治療上的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)。

納米顆粒能與DNA結(jié)合形成復(fù)合物，納米載體與DNA分子的偶聯(lián)可以通過靜電吸附，也可以通過化學(xué)鍵結(jié)合。這種結(jié)合能夠有效地保護(hù)與納米顆粒結(jié)合的外源DNA，使之免受各種酶的消化，提高了轉(zhuǎn)染效率。納米顆粒在生物體及細(xì)胞內(nèi)外具有高的穩(wěn)定性，不易被降解［30］，且因其亞細(xì)胞的尺寸效應(yīng)容易被細(xì)胞吞噬，通過細(xì)胞的吞噬作用可攜帶核酸進(jìn)入細(xì)胞，納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞后可以快速地從溶酶體中逃逸出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。納米顆粒可介導(dǎo)DNA在細(xì)胞核染色體基因組上整合，獲得外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。

3 納米基因載體的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

理想的納米載體基因復(fù)合物是帶有大量正電荷，這樣更容易通過靜電作用吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜，從而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用。納米載體基因復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞到發(fā)揮作用需要克服一系列屏障［26，31，32］。首先，納米載體基因復(fù)合物與細(xì)胞膜等形成內(nèi)含體，溶酶體迅速將內(nèi)含體吞噬，在溶酶體內(nèi)如果納米顆粒不能有效地保護(hù)基因，并且基因不能及時(shí)有效地被釋放，則會(huì)被溶酶體酶降解，外源基因能否及時(shí)有效地從溶酶體中逃逸是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵步驟。當(dāng)發(fā)生內(nèi)吞作用后，內(nèi)含體膜上的ATP酶激活，利用ATP水解的能量將胞質(zhì)中H+泵入，從而降低了內(nèi)含體內(nèi)的pH，使溶酶體酶發(fā)揮分解作用。如果納米載體表面含有能在生理pH條件下發(fā)生質(zhì)子化的氮原子（如PEI中的N），它就會(huì)結(jié)合累積的質(zhì)子從而抑制內(nèi)含體pH的降低。質(zhì)子不斷泵入內(nèi)含體內(nèi)，并伴隨著氯離子的被動(dòng)流入使得內(nèi)含體內(nèi)的pH不斷升高，這不僅可以抑制溶酶體內(nèi)酶對(duì)外源DNA的降解作用，同時(shí)可引起內(nèi)含體腫脹、崩解，從而釋放出納米載體基因復(fù)合物。納米載體基因復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，為盡快地讓基因從溶酶體內(nèi)逃逸，也可以使用溶酶體釋放劑，如氯喹、聚乙烯吡咯酮、蔗糖等［33］。當(dāng)外源基因從內(nèi)含體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，它是否不被胞質(zhì)內(nèi)酶降解，并順利進(jìn)入核內(nèi)也影響著基因功能的發(fā)揮?；蜻M(jìn)入核內(nèi)有兩個(gè)途徑，一是細(xì)胞分裂時(shí)，核膜破裂；另一是經(jīng)核孔進(jìn)入，具體機(jī)制目前仍不清楚。

4 納米基因載體研究進(jìn)展

納米基因載體通常是由生物兼容性材料制備而成的納米微囊或納米粒子，可以通過包裹或吸附外源DNA等核酸分子形成納米載體基因復(fù)合物。納米載體粒徑通常在10-100 nm之間，其巨大的比表面積所產(chǎn)生的化學(xué)活性，使其具有很高的吸附、濃縮和保護(hù)DNA的能力，這是納米基因載體對(duì)外源基因發(fā)揮吸附、運(yùn)轉(zhuǎn)功能的主要原因之一。納米顆粒因其粒徑小可以通過細(xì)胞內(nèi)吞作用攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)胞，隨后釋放基因分子發(fā)揮功能［34］。納米基因載體采用的材料分為有機(jī)材料和無機(jī)材料兩類，有機(jī)材料主要是高分子聚合物，包括樹枝狀聚合物、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺和殼聚糖；無機(jī)材料主要包括二氧化硅、氧化鐵和量子點(diǎn)等。

4.1 有機(jī)材料

4.1.1 PAMAM樹枝狀大分子（poly-amidoamine dendrimer） 樹枝狀大分子是一類球形、高度支化的高分子，這類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從中心原子或中心環(huán)上輻射出很多分支。PAMAM（Poly-amidoamine）樹枝狀大分子是1985年由Tomalia等合成的，可通過表面所帶的陽離子和DNA通過靜電作用結(jié)合，可攜帶不同大小的DNA片段，所形成的體系穩(wěn)定。另外，它具有很好的分散性，良好的生物相容性，較高的轉(zhuǎn)染效率，較低的細(xì)胞毒性，可以轉(zhuǎn)染多種原代細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率與代數(shù)及其支化程度密切相關(guān)［35，36］。PAMAM樹狀分子表面含有大量官能團(tuán)易于進(jìn)行修飾改性，從而進(jìn)一步降低細(xì)胞毒性，提高轉(zhuǎn)染效率［37，38］。Liu等［39］以三羥乙基胺為核合成了PAMAM樹狀大分子，該樹狀大分子能攜帶綠色熒光蛋白基因進(jìn)入細(xì)胞和鼠的胸腺中進(jìn)行表達(dá)。PAMAM可攜帶SiRNA進(jìn)入癌細(xì)胞干擾靶基因的表達(dá)［40，41］。

4.1.2 多聚賴氨酸（poly-L-Lysine，PLL） 多聚賴氨酸是一種陽離子多肽，是較早用于轉(zhuǎn)運(yùn)基因的高分子聚合物納米材料。目前，多聚賴氨酸作為非病毒基因載體得到廣泛的應(yīng)用［42］。多聚賴氨酸具有生物可降解性，有助于體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于多聚賴氨酸/DNA復(fù)合物不能快速的從內(nèi)含體中釋放，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低，并且細(xì)胞毒性大，但它易于進(jìn)行表面修飾，如連接親水聚合物、配體及融膜多肽，從而降低毒性，提高轉(zhuǎn)染效率。聚乙二醇（PEG）是一類親水的、具有生物相容性的聚合物，具有較好的穩(wěn)定性，以PEG制成納米顆粒表面修飾PLL作為基因載體，可以降低細(xì)胞的毒性，很好的結(jié)合DNA，增加納米顆粒/DNA復(fù)合物的水溶性，提高轉(zhuǎn)染效率［43］。

4.1.3 聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI） PEI是應(yīng)用最廣泛和最有效的非病毒載體之一［44］，聚乙烯亞胺表面帶有較高的正電荷，可以吸附DNA分子，濃縮DNA分子，保護(hù)DNA免受酶解，實(shí)現(xiàn)DNA分子的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。由于PEI具有“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，使得其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率較高。聚乙烯亞胺可以結(jié)合泵入核內(nèi)體的H+，具有很強(qiáng)的H+緩沖能力，避免溶酶體酶對(duì)DNA的降解作用，對(duì)DNA具有很好的保護(hù)作用，同時(shí)會(huì)伴隨著Cl-的大量內(nèi)流，造成核內(nèi)體腫脹破裂，使基因快速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用［45，46］。由于PEI與病毒載體相比，具有相對(duì)低的轉(zhuǎn)染效率，并且缺乏組織靶向性，限制了PEI的使用，尤其是體內(nèi)基因的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此目前的研究集中在提高基因轉(zhuǎn)染效率和載體的靶向性［47］，可在PEI表面修飾抗體［48］、肽［49］、乳鐵蛋白［50］、甘露糖醛酸［51］及葉酸［52］等配體。這些修飾既可以提高基因的轉(zhuǎn)染效率，又可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的靶向性，同時(shí)可以降低對(duì)其他組織細(xì)胞的副作用。

4.1.4 殼聚糖（chitosan，CS） 殼聚糖是一種天然高分子聚合物，由甲殼素經(jīng)過部分脫乙酰作用形成的氨基多糖，具有很好的生物相容性，在體內(nèi)可被降解，且分解產(chǎn)物對(duì)人體無害。作為基因載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，可以增強(qiáng)DNA的穩(wěn)定性，有效地保護(hù)DNA免受酶的降解作用［53，54］。

4.2 無機(jī)材料

無機(jī)納米材料穩(wěn)定，分散性好，制備方便，粒徑容易控制，裝載量大，無免疫原性，細(xì)胞毒性小，易于在表面偶聯(lián)特異性分子而實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸，提高轉(zhuǎn)染效率。目前應(yīng)用較多的有硅納米顆粒［55］，氧化鐵顆粒［56］，硫酸鈣顆粒［57］和納米金顆粒［58］等。

5 結(jié)語

為了提高納米顆粒/DNA的轉(zhuǎn)染效率，可以對(duì)納米顆粒進(jìn)行表面修飾以改善顆粒的表面結(jié)構(gòu)和性能。DNA磷酸骨架在生理pH下帶負(fù)電，可以與帶正電的基因載體有效結(jié)合。因此，在納米顆粒表面修飾攜帶陽性電荷的物質(zhì)，如多聚賴氨酸、PEI，更有利于納米顆粒/DNA復(fù)合物的形成。納米顆粒作為基因載體進(jìn)行基因治療時(shí)的靶向性比較差，可在其表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，并通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸［59］。

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