孫 菲,李 萍,徐涓娟,陳 華,吳子燕,欒海霞, 張 文,田新平,李永哲,張奉春
(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100032)
ChinJAllergyClinImmunol,2013,7(2):103-108
原發(fā)性干燥綜合征(primary sj?gren’s syndrome,pSS)是一種多發(fā)于中老年女性,以外分泌腺受累為主要特征的慢性自身免疫性疾病。研究表明,遺傳因素對(duì)pSS疾病的發(fā)病、臨床表現(xiàn)及自身抗體的產(chǎn)生等都有一定影響[1]。和其他一些相關(guān)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)相比,pSS的遺傳背景研究相對(duì)落后[2]。
近年來(lái),SLE等其他自身免疫性疾病的大規(guī)模候選基因關(guān)聯(lián)分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome-wide association studies,GWAS)為pSS的遺傳背景研究提供了很好的線索與依據(jù)。包含漢族人群在內(nèi)的2項(xiàng)關(guān)于SLE的GWAS均表明ETS1基因多態(tài)性與SLE密切相關(guān)[3-4],在其他人群中也有研究證實(shí)了ETS1與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)及炎性腸病的相關(guān)性[5-6]。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于ETS1與pSS的相關(guān)性研究。本研究選取了ETS1基因上2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)(rs6590330和rs1128334),旨在漢族人群中驗(yàn)證ETS1基因多態(tài)性是否與pSS遺傳易感性相關(guān)。
嚴(yán)格按照2002年干燥綜合征國(guó)際分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]收集2008年9月至2011年11月期間在北京協(xié)和醫(yī)院就診的pSS患者臨床資料。同時(shí),選擇北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心的健康體檢者作為對(duì)照,健康對(duì)照者均無(wú)自身免疫性疾病史及家族史。本研究所納入的研究對(duì)象均為漢族人。
基因組DNA提取:抽取pSS患者和健康對(duì)照者靜脈血2 ml,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,采用全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。將2 ml全血與4 ml紅細(xì)胞裂解液混勻,離心、棄上清后再次加入紅細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞完全裂解,在離心沉淀后的白細(xì)胞中加入2 ml細(xì)胞核裂解液使DNA析出,后加入1 ml蛋白沉淀液離心棄去蛋白質(zhì),加入2 ml異丙醇使DNA沉淀,離心后得到的DNA中加入2 ml 70%乙醇洗滌,待DNA晾干加入1 ml溶解液,分光光度計(jì)測(cè)量濃度(>20 ngμl)及純度(A260280=1.7~1.9),瓊脂糖電泳示DNA無(wú)降解,DNA置于―20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
基因分型:所有研究對(duì)象的DNA樣本通過(guò)Sequenom MassArray系統(tǒng)進(jìn)行分型。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增及延伸引物使用MassARRAY Assay Design 3.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1),由博淼生物科技有限公司進(jìn)行合成。首先通過(guò)多重PCR擴(kuò)增出含有所選SNP位點(diǎn)的目的DNA片段,然后經(jīng)過(guò)蝦堿酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)消化反應(yīng)去除PCR擴(kuò)增體系中未反應(yīng)的堿基及非特異性產(chǎn)物。SAP反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行位點(diǎn)特異性延伸反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)脫鹽處理后轉(zhuǎn)移至廠家提供的384孔SpectroCHIP陣列,最后使用MALDI-TOF-MS進(jìn)行等位基因檢測(cè),質(zhì)譜結(jié)果采用MassARRAY TYPER軟件進(jìn)行分析。
最終分型數(shù)據(jù)使用PLINK 1.07統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。Hardy-Wemberg平衡定律檢驗(yàn)所選SNP位點(diǎn)在人群中的分布情況。關(guān)聯(lián)分析中,各SNP位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行2×2和2×3列聯(lián)表的χ2檢驗(yàn)。計(jì)算比值比(odd ratio,OR)、雙側(cè)95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)和P值,以P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各遺傳模型(加性模型、顯性模型、隱性模型)下的分析通過(guò)logistic回歸進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。
表1 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6590330和rs1128334引物序列
pSS組:共納入pSS患者261例,其中女250例,男11例,平均年齡(47.6±12.6)歲。抗SSA抗體陽(yáng)性患者235例,抗SSB抗體陽(yáng)性患者120例(雙擴(kuò)散法)。
對(duì)照組:共納入597例健康體檢者,其中女576例,男21例,平均年齡(49.5±9.3)歲。
rs6590330和rs1128334分型成功率分別為94.5%和36.9%,rs1128334分型成功率小于80.0%,所以不能進(jìn)行下一步分析。Hardy-Wemberg平衡定律檢驗(yàn),rs6590330在pSS組和對(duì)照組中均符合遺傳平衡定律(P>0.05),具有群體代表性。
A等位基因頻率在pSS組中分別為42.5%、44.9%、12.6%、65.0%和35.0%,在對(duì)照組中分別為41.8%、47.5%、10.6%、65.6%和34.4%,基因型和等位基因分布差異在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[基因型χ2=0.822,P=0.663;等位基因χ2=0.059,P=0.808,OR=1.028,95%CI為(0.823,1.283)](表2)。3種不同遺傳模型下分析顯示,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。
pSS多發(fā)于女性,性別因素在一定程度上影響疾病的發(fā)生。因此,本研究去除男性研究對(duì)象后,進(jìn)一步行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示,兩組間差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[基因型χ2=1.252,P=0.535;等位基因χ2=0.342,P=0.558,OR=1.070,95%CI為(0.854,1.340)](表4)。
將抗SSA和抗SSB抗體陽(yáng)性的pSS組患者分別與對(duì)照組比較,同樣rs6590330位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在抗體陽(yáng)性組與對(duì)照組之間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表5)。
表2 rs6590330基因型和等位基因在pSS組與對(duì)照組間比較
pSS:原發(fā)性干燥綜合征
表3 3種遺傳模型下rs6590330的分析
pSS:原發(fā)性干燥綜合征
表4 女性rs6590330基因型和等位基因在pSS組和對(duì)照組的分布
pSS:原發(fā)性干燥綜合征
表5 rs6590330與抗SSA抗體和抗SSB抗體相關(guān)性分析
a與對(duì)照組相比,χ2=1.457,P=0.483;b與對(duì)照組相比,χ2=1.814,P=0.404;c與對(duì)照組相比,比值比=1.049,95%可信區(qū)間(0.834,1.320);d與對(duì)照組相比,比值比=0.960,95%可信區(qū)間(0.710,1.296)
盡管pSS是一種主要累及外分泌腺的自身免疫性疾病,但在臨床特征和發(fā)病機(jī)制方面卻與其他自身免疫性疾病如SLE存在一些共同點(diǎn),如抗SSA和抗SSB等抗體的產(chǎn)生[8]、B淋巴細(xì)胞過(guò)度活化及干擾素-α(interferon-α,IFN-α)信號(hào)通路激活[9]等。在遺傳背景方面,同樣與其他自身免疫性疾病密切相關(guān),pSS患者的一級(jí)親屬患有pSS、SLE或其他自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)更大[10];且與其他自身免疫性疾病存在著一些共同的遺傳易感區(qū)域,如人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因區(qū)域及HLA基因以外的STAT4和IRF5等基因[11-12]。鑒于ETS1基因與SLE和RA等疾病的相關(guān)性,以及pSS與這些疾病在遺傳背景方面有一定程度的重疊性,所以認(rèn)為ETS1基因可能同樣與pSS易感性相關(guān)。然而,本研究未發(fā)現(xiàn)ETS1基因和pSS之間存在任何相關(guān)性。這說(shuō)明ETS1基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性在不同疾病中存在著差異。
ETS1基因位于染色體11q23.3上,其編碼產(chǎn)物是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,含有一個(gè)保守的靶基因結(jié)合域,可識(shí)別靶基因上的保守的GGAAT DNA序列,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。ETS1可廣泛的參與多種免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控細(xì)胞因子的基因表達(dá),從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[13]。首先,ETS1是B細(xì)胞終末分化的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白,ETS1缺陷的B細(xì)胞在數(shù)目正常的情況下,分泌IgM的漿細(xì)胞比例明顯升高[14];且有研究表明,ETS1是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白1(Blimp-1)來(lái)調(diào)控漿細(xì)胞的分化[15]。另一方面,ETS1可促進(jìn)輔助T1細(xì)胞(T helper cell 1,Th1)、抑制Th17細(xì)胞的分化[16-17],還可影響自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞和NK T細(xì)胞的發(fā)育[18]。已有研究表明,SLE患者中ETS1基因mRNA表達(dá)水平較健康對(duì)照降低[19]。目前的研究證實(shí),ETS1在免疫調(diào)節(jié)及SLE疾病發(fā)生過(guò)程中起到一定作用[20]。對(duì)于pSS這種以B細(xì)胞過(guò)度活化為特征并伴有其他多種免疫細(xì)胞功能紊亂及多種細(xì)胞因子分泌異常的疾病[21],ETS1基因功能是否會(huì)參與pSS疾病發(fā)生有待于去證實(shí)。本研究初步從ETS1基因多態(tài)性出發(fā),并未發(fā)現(xiàn)ETS1與pSS的相關(guān)性,但并不能完全否認(rèn)其在pSS中可能存在的作用。
本研究選取ETS1基因上和漢族人群SLE相關(guān)性最密切的2個(gè)SNP位點(diǎn),由于rs1128334分型成功率過(guò)低未能進(jìn)一步分析。rs6590330位點(diǎn)A等位基因和AA基因型頻率在pSS組中升高,這種趨勢(shì)和SLE中的研究結(jié)果一致[3-4]。但這種分布差異在基因型和等位基因頻率的基本分析及各遺傳模型下的分析中都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于SLE的研究發(fā)現(xiàn),一些SNP位點(diǎn)與疾病本身不存在相關(guān)性,而與疾病的某些亞型密切相關(guān)[22]。所以,本研究將pSS組患者按性別及抗體產(chǎn)生情況進(jìn)行分組并進(jìn)一步分析。由于樣本數(shù)量有限,研究只針對(duì)女性pSS組、抗SSA抗體組和抗SSB抗體組進(jìn)行了分析,結(jié)果仍未發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)性。
通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn),rs6590330與pSS不存在相關(guān)性。這可能是由于SLE和pSS疾病之間遺傳背景的差異造成的,即ETS1基因多態(tài)性對(duì)兩種疾病易感性的影響有所不同。另外,ETS1基因上與pSS密切相關(guān)的可能是rs6590330以外的其他位點(diǎn)。最后,還應(yīng)考慮到本研究樣本量和SLE的研究相比相對(duì)有限,對(duì)pSS其他臨床表現(xiàn)的亞型分析尚不能開展,有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量去驗(yàn)證。總之,本研究發(fā)現(xiàn)與SLE等疾病密切相關(guān)的ETS1基因多態(tài)性與pSS的易感性并不相關(guān),這說(shuō)明ETS1基因并非pSS與其他自身免疫性疾病的共同易感基因。
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