楊志誠 趙云剛 劉明雨

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤，居全世界惡性腫瘤死因的第二位，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。侵襲轉移是結直腸癌的重要死亡原因，也是影響臨床治療和預后的主要因素。研究表明，多種生物因子與腫瘤的侵襲轉移相關。本實驗應用免疫組化SP法檢測凋亡抑制因子Survivin和核因子-κB(NF-κB)在65例結直腸癌標本中的表達，探討Survivin和 NF-κB與結直腸癌病理參數(shù)的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2009年9月至2012年3月手術切除的原發(fā)性結直腸癌患者標本65例，其中，男38例，女27例;所有標本均有明確病理分型，患者術前均未接受放療、化療;有結直腸癌家族史者不納入本試驗。結腸癌35例，直腸癌30例;低分化癌28例，中、高分化癌37例;有淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移35例;DukesA期13例，B期21例，C期28例，D期3例。并取40例患者癌旁正常組織，距腫瘤邊緣10 cm以上各1塊。中性甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制備4 μm厚連續(xù)病理切片，切片分別進行HE染色和免疫組織化學染色。

1.2 免疫組織化學染色 兔抗人Survivin、NF-κB多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP試劑盒、DAB試劑盒購自中杉金橋公司。切片脫蠟至水，采用免疫組織化學鏈霉素-生物素過氧化酶(SP)染色法，切片置于抗原修復液(0.01 mol/L檸檬酸鹽)中高壓鍋熱修復30 min，在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡10 min以滅活內源性過氧化氫酶，10%山羊血清封閉10 min，加入 Survivin抗體(稀釋度1∶200)、NF-κB 抗體(稀釋度 1∶300)，4℃過夜，免疫組織化學染色均按SP試劑盒推薦方法進行。

1.3 結果判斷 細胞膜和(或)細胞質中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Survivin陽性細胞，細胞質和(或)細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB陽性細胞。判斷采用半定量積分法［2］，記數(shù)5個高倍視野，將平均陽性細胞率分為5類:0分＜5%;1分5% ～＜25%;2分25% ～＜50%;3分50% ～＜75%;4分≥75%。根據(jù)陽性染色強度分為4類:無著色0分;淡黃色1分;黃色2分;棕黃色3分;兩者積分相加，按積分高低分為:0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。把弱陽性、陽性、強陽性均定義為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗、四格表概率法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Survivin、NF-κB在結直腸癌組織中及癌旁正常組織中的表達 Survivin蛋白陽性反應物主要位于癌旁和癌細胞胞質中，為淺黃和棕黃色，染色均勻，癌組織表達的陽性率為72.31%(47/65)。正常大腸黏膜中未見 Survivin蛋白表達，癌組織與對照非癌組織中表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。NF-κB蛋白陽性反應物位于胞漿和(或)細胞核，結直腸癌中NF-κB的陽性率為58.46%(38/65)，癌旁正常組織的陽性率為17.5%(7/40)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 Survivin、NF-κB在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 Survivin、NF-κB蛋白的陽性表達均與患者的年齡、性別、腫瘤大小無相關性(P＞0.05)，與癌組織的Dukes分期、分化程度和淋巴結轉移相關(P＜0.01)。

2.3 Survivin、NF-κB蛋白在結直腸癌中表達的關系 47例Survivin陽性表達病例中NF-κB陽性表達32例，18例Survivin陰性表達病例中NF-κB陽性表達6例，Survivin與NF-κB的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.373，P=0.012)。隨機計數(shù)5個高倍視野的Survivin與NF-κB均表達陽性的細胞數(shù)，Survivin與NF-κB 的陽性表達率呈正相關(r=0.75，P＜0.01)。

3 討論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展機制尚未完全明了。NF-κB存在于體內多種細胞中，NF-κB與其調節(jié)蛋白IKB-α結合后在細胞質中以非活性形式存在，通過IKB激酶(IKK)作用，IKB-α可發(fā)生32、36位的絲氨酸磷酸化而降解，并與NF-κB分離，NF-κB轉位進入細胞核內與靶基因啟動子結合，迅速誘導靶基因 mRNA的合成，參與多種疾病的發(fā)病過程［3］。在腫瘤細胞中，NF-κB可以調節(jié)許多基因，包括增殖相關基因(cyclinD1，COX2，and c-Myc)、抗凋亡相關基因(survivin，Bcl-2)、侵襲相關基因(MMP-9 and ICAM-1)等［4］。本實驗發(fā)現(xiàn)，NF-κB在結直腸癌組織中的陽性表達率為58.46%，與對照非癌組織的陽性率17.5%相比，差異有統(tǒng)計學意義。目前的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的凋亡抑制可能在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中起重要作用［5］。

Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，可抑制多種刺激因素誘導的凋亡，使細胞存活，有利于細胞的異常增殖和惡性轉化，進而導致腫瘤的發(fā)生［6］。Survivin可能通過下列途徑抑制細胞凋亡:(1)抑制凋亡終末效應蛋白 caspase-3、caspase-7的活性，從而有效的阻斷細胞凋亡過程［7］。(2)與細胞周期調控因子周期蛋白激酶CDK4形成復合體，使 p21從CDK4復合體中釋放出來，并移位到線粒體中與caspase3特異性結合，間接抑制caspase3活化，阻止線粒體釋放細胞色素 C，從而起到抗凋亡作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在結直腸癌組織中的表達陽性率為72.31%，與對照非癌組織相比，差異有統(tǒng)計學意義。

本實驗也證實在結直腸癌組織中，Survivin與NF-κB之間表達呈顯著正相關(r=0.75)。并且 Survivin、NF-κB蛋白在結直腸癌組織中的表達與癌組織的分化程度、淋巴結轉移和Dukes分期相關(P＜0.01)，說明 NF-κB及 Survivin在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中起著重要作用。

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2 Kawasaki H，Altieri DC，Lu CD，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer.Cancer Res，1998，58:5071-5074.

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4 Yang P，Guo L，Duan ZJ，et al.Histone Methyltransferase NSD2/MMSET Mediates Constitutive NF-κB Signaling for Cancer Cell Proliferation，Survival，and TumorGrowth via a Feed-Forward Loop.Mol Cell Biol，2012，32:3121-3131.

5 Yoriaki S，Takehiko K，Takashi Y，et al.The incidence of apoptosis during colorectal tumorigenesis.Int J Surg Pathol，2000，8:123-132.

6 Angela F，Natalie R，Sam W，et al.Survivin，a member of the inhibitor of apoptosis family，is iInduced by photodynamic therapy and is a target for improving treatment response.Cancer Res，2007，67:4989-4995.

7 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21complex formation as a result ofinteraction with cdk4 to resist Fas-mediated cell death.Oncogene，2000，19:1346-1353.

8 Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural functional and therapeutic biology of Survivin.Cancer Lett，2006，244:164-171.