黃 紅，那 宇

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍306臨床醫(yī)院，北京 100101;2 中國(guó)人民解放軍306醫(yī)院)

目前，泌尿系統(tǒng)的獲得性免疫已經(jīng)獲得廣泛研究，而固有免疫的研究雖已開(kāi)展120多年，研究的方向卻很局限。既往研究大多數(shù)局限在皮膚或黏膜的屏障作用、體液的殺菌作用、單核巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞的吞噬作用、自然殺傷(NK)細(xì)胞的殺傷作用、炎性因子的炎癥作用等方面。隨著20世紀(jì)90年代模式識(shí)別受體(PRR)概念的提出，特別是Toll樣受體(Toll-Like Receptors，TLRs)的發(fā)現(xiàn)，泌尿系統(tǒng)的固有免疫研究進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段。現(xiàn)將TLRs及其在尿路感染發(fā)病中作用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 TLRs在泌尿系統(tǒng)的分布

目前已發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中的TLRs至少有13種，其中在人體表達(dá)的TLRs為T(mén)LR1～TLR10。整個(gè)尿路包括尿道、膀胱、輸尿管中均有多種TLRs的分布。Pudney等［1］對(duì)正常男性和HIV陽(yáng)性患者生殖系統(tǒng)進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，男性尿道海綿部的白細(xì)胞內(nèi)有TLR2、TLR3、TLR5、TLR7 和 TLR9 表達(dá)，并且是生殖系統(tǒng)中表達(dá)TLRs最多的部位，前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)也有各種 TLRs的表達(dá)。Ayari等［2］通過(guò)反轉(zhuǎn)錄方法發(fā)現(xiàn)，正常人膀胱上皮細(xì)胞可表達(dá) TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7 和 TLR9。徐華超等［3］從腎全切除術(shù)的腎腫瘤患者腎臟組織中分離腎小管、腎盂、輸尿管和膀胱上皮，進(jìn)行原代培養(yǎng)和細(xì)胞鑒定，也發(fā)現(xiàn)上述組織均有TLR2和TLR4的表達(dá)。

目前泌尿系統(tǒng)中研究最多的三種TLRs是TLR4、TLR5和TLR11。TLR4在膀胱和腎臟均有表達(dá)，TLR5主要在膀胱表達(dá)，TLR11主要在腎臟表達(dá)［4］。以TLR4在膀胱炎中的固有免疫研究最為深入。TLR11主要在小鼠腎臟表達(dá)，缺乏TLR11的小鼠腎臟表現(xiàn)出對(duì)致腎盂腎炎細(xì)菌的高度易感性。人類缺乏 TLR11的表達(dá)，雖然實(shí)驗(yàn)證明人體存在TLR11的短縮形式 ，但呈失活狀態(tài)，此可能為人體易發(fā)生泌尿系感染的重要原因［5］。

2 TLRs識(shí)別的配體

TLRs屬于I型跨膜蛋白，其胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)相似，稱為T(mén)IR(Toll/IL-1 receptor homologous region)，負(fù)責(zé)受體活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而胞外區(qū)結(jié)構(gòu)有富含亮氨酸的重復(fù)序列，負(fù)責(zé)識(shí)別不同的病原分子。針對(duì)不同的病原體，TLRs可識(shí)別不同生物上的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，每一類TLR單獨(dú)或與輔助因子結(jié)合可識(shí)別一種或幾種PAMPs。

TLR1可識(shí)別三?；?、可溶性因子。TLR2主要識(shí)別G+細(xì)菌的肽聚糖、脂蛋白和脂磷酸壁，亦可識(shí)別G-細(xì)菌的脂蛋白、支原體和螺旋體、真菌或膜孔蛋白的酵母聚糖、腎臟鉤端螺旋體等。TLR4主要識(shí)別G-細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(LPS)成分。除LPS外，TLR4還可識(shí)別磷壁酸、呼吸道合胞病毒F蛋白等配體。TLR5可識(shí)別細(xì)菌的鞭毛，鞭毛素D295和D367區(qū)域是細(xì)菌鞭毛的主要組成部分，可與TLR5在細(xì)胞表面結(jié)合。TLR6可識(shí)別支原體的二?；鞍?、G+細(xì)菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖等。TLR9可識(shí)別未甲基化CpG-DNA。TLR11可識(shí)別尿路致病性大腸桿菌(UPEC)，其配體目前還不清楚，且不存在于非致病性大腸埃希菌和G+細(xì)菌中。此外還有TLR3、TLR7、TLR9，被認(rèn)為是最主要的識(shí)別病毒核酸的模式識(shí)別受體［6］。最近研究表明，TLRs還可識(shí)別某些內(nèi)源性配體，如 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6 可識(shí)別熱休克蛋白、壞死的小管細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分等［7］。

細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、病毒、寄生蟲(chóng)等均能引起尿路感染。因?yàn)?5%以上的尿路感染是G-細(xì)菌感染，故TLR4在尿路感染者固有免疫中的作用最顯著。TLR11因配體尚不清楚，成為目前研究的重點(diǎn)。2005年Yarovinsky等［8］對(duì)鼠弓形蟲(chóng)的研究證實(shí)，弓形蟲(chóng)內(nèi)的一種Profiling樣蛋白可通過(guò)與TLR11結(jié)合激活樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，啟動(dòng)骨髓分化蛋白88(MyD88)依賴性信號(hào)通路，首次從化學(xué)上定義了TLR11的配體。近年研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)存在與鼠弓形蟲(chóng)中的Profiling樣蛋白有相似結(jié)構(gòu)域的一種蛋白，血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)能否找到與TLR11結(jié)合的配體成為今后的一個(gè)研究方向。此外，TLR11與TLR5具有相似的多態(tài)現(xiàn)象，人尿道細(xì)菌菌毛上是否存在一種鞭毛樣蛋白能與TLR11結(jié)合亦為今后研究的焦點(diǎn)。目前關(guān)于TLRs在G-細(xì)菌感染中的研究已經(jīng)很多，在其他病原體感染中所扮演的角色也越來(lái)越受到關(guān)注［9］。

3 TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

3.1 經(jīng)典途徑 即MyD88-NF-κB途徑。所有的TLRs均可啟動(dòng)MyD88依賴途徑，且在尿路各段發(fā)生炎癥時(shí)都可啟動(dòng)。此途徑有四類接頭蛋白:MyD88、包含TIR的接頭蛋白、包含TIR的接頭分子1(TICAM-1)、TICAM-2。其中MyD88是TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的連接蛋白，位于胞內(nèi)，是TIR的接頭蛋白，由一個(gè)N端死亡域(DD)和一個(gè) C端 TIR(Toll/IL-1R)域組成。配基與TLR胞外段結(jié)合，使之二聚化并與MyD88的Toll結(jié)構(gòu)域結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)MyD88的DD活化，MyD88通過(guò)DD募集含有DD結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子并使信號(hào)向下傳導(dǎo)，可激活NF-κB。NF-κB活化后游離釋放并轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子一起協(xié)同誘導(dǎo)促炎因子IL-1、IL-6、IL-8等基因的表達(dá)，參與天然免疫應(yīng)答。

3.2 MyD88非依賴途徑 MyD88非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑是某些TLRs(如TLR3、TLR4)所特有，β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)是其中的一個(gè)接頭蛋白，主要參與INF-β調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)激活。TLR4可通過(guò)接頭分子Trif介導(dǎo)下游的信號(hào)傳導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB，繼而介導(dǎo)一系列 NF-κB參與的基因表達(dá)、激活Caspase及誘導(dǎo)共刺激分子表達(dá)。

經(jīng)典途徑被認(rèn)為是尿路感染固有免疫最重要的途徑。但最新研究表明，在膀胱炎中存在一種cAMP/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)途徑，且此途徑比經(jīng)典途徑更迅速、快捷［10］。此信號(hào)途徑的啟動(dòng)需要cAMP首先和它相關(guān)的傳遞因子CREB結(jié)合。膀胱表面淺層上皮細(xì)胞(BECs)上的腺苷酸環(huán)化酶(AC)可引起細(xì)胞內(nèi)cAMP上升。AC有四種亞型，其中 AC3為細(xì)胞暴露于大腸埃希菌后產(chǎn)生cAMP上升的特異亞型，升高的cAMP可經(jīng)過(guò)蛋白激酶A(PKA)使CREB磷酸化，后者可使IL-6、IL-8表達(dá)上調(diào)。

4 TLRs與尿路感染

盡管很多種TLRs都在泌尿系統(tǒng)表達(dá)，但目前發(fā)現(xiàn)只有TLR4、TLR5和TLR11在活體感染時(shí)發(fā)揮抗菌作用。上述三種基因敲除的小鼠在尿路任意區(qū)域發(fā)生感染時(shí)抗感染能力均減退［4］。在尿路感染中作用最明確的是TLR4。任何細(xì)胞缺乏TLR4均將會(huì)損傷機(jī)體對(duì)UPEC的防御機(jī)制，增加無(wú)癥狀菌尿(ASB)或膿尿的患病率。Tamm-Horsfall蛋白是健康人尿液中具有抗菌活性的蛋白，可通過(guò)TLR4信號(hào)途徑減輕腎臟炎癥損傷和穩(wěn)定腎外髓質(zhì)［11］，此進(jìn)一步證實(shí)TLR4在防御泌尿系感染中發(fā)揮重要作用。

4.1 膀胱炎 TLR4在膀胱發(fā)揮固有免疫作用主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面:激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎作用;抑制細(xì)菌侵入;促進(jìn)細(xì)菌排出。TLR4與協(xié)同受體CD14廣泛表達(dá)在鼠和人類BECs上，BECs表面的 TLR4/CD14復(fù)合物識(shí)別 G-菌的LPS后可激活兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(經(jīng)典途徑和cAMP/CREB途徑)，最終均通過(guò)促進(jìn)IL-6、IL-8的分泌發(fā)揮抗感染作用［10］。在膀胱壁淺層內(nèi)存在一種紡錘體小囊泡，其為一種動(dòng)態(tài)cAMP調(diào)節(jié)的圓盤(pán)狀小囊泡，這些小囊泡高度富集脂筏成分，UPEC侵入BECs后裝入這些小囊泡內(nèi)［4］。故BECs上的TLR4還可通過(guò)激活cAMP/CREB途徑調(diào)節(jié)cAMP的表達(dá)從而抵御UPEC的侵入。細(xì)胞內(nèi)增加的cAMP通過(guò)下游的效應(yīng)分子PKA發(fā)揮級(jí)聯(lián)效應(yīng)抑制Rac-1的活性。Rac-1是BECs上脂筏決定簇的組成成分，并且是肌動(dòng)蛋白重組和細(xì)菌侵入的必要元件。BECs在UPEC侵入細(xì)胞后仍能通過(guò)TLR4的激活排除細(xì)菌，此過(guò)程涉及的主要物質(zhì)仍然是cAMP，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的cAMP是紡錘體小囊泡及其攜帶的細(xì)菌發(fā)生胞吐的一個(gè)強(qiáng)有力的啟動(dòng)子。Bishop等［12］報(bào)道，用Forskolin(一種能提高胞內(nèi)cAMP的物質(zhì))處理小鼠，能夠引起膀胱紡錘體小囊泡進(jìn)入淺層漿膜崩潰，隨之UPEC在感染的膀胱內(nèi)數(shù)量下降。

4.2 腎盂腎炎 發(fā)生腎盂腎炎時(shí)，帶有I型菌毛或P菌毛的UPEC優(yōu)先黏附到髓質(zhì)集合管上皮細(xì)胞上形成菌落。一方面機(jī)體通過(guò)釋放ɑ-溶血素刺激Ca2+釋放，繼而促進(jìn) IL-6、IL-8的釋放;另一方面UPEC菌毛的LPS成分被TLR4識(shí)別，通過(guò)MyD88-NF-κB途徑引起腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，趨化中性粒細(xì)胞啟動(dòng)固有免疫［13］。有研究者通過(guò)TLR4突變鼠和野生鼠之間骨髓交叉移植制造了一種新動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UPEC感染后，缺乏功能性TLR4小鼠的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞不能募集中性粒細(xì)胞，不易形成腎膿腫，但在腎內(nèi)有很多UPEC菌團(tuán)［14］。以往認(rèn)為T(mén)LR4基因缺失僅可導(dǎo)致ASB;最新研究發(fā)現(xiàn)，TLR4發(fā)揮固有免疫的另一條途徑即MyD88非依賴途徑中的IRF-3基因缺失時(shí)，機(jī)體將發(fā)生嚴(yán)重腎臟感染［15］。IRF-3基因缺失的小鼠與對(duì)照組相比，早期腎膿腫形成無(wú)明顯差異，但后期對(duì)照組可更早的呈現(xiàn)修復(fù)狀態(tài)。此研究還通過(guò)制作LPS敏感及不敏感、MyD88基因缺失的小鼠模型，進(jìn)一步證實(shí)TLR4在腎臟感染時(shí)發(fā)揮重要作用。

4.3 ASB 新近發(fā)現(xiàn)，ASB的發(fā)生與宿主的TLR表達(dá)有關(guān)。ASB患兒中性粒細(xì)胞的TLR4表達(dá)水平明顯低于健康小兒，且原發(fā)ASB患兒的TLR4表達(dá)水平明顯低于初次尿路感染后繼發(fā)ASB患兒。ASB患兒的TLR4接頭蛋白水平升高，TLR4抑制因子水平下降。Fischer等［16］發(fā)現(xiàn)，TLR4敲除的小鼠可表現(xiàn)為ASB;Suhs等［17］發(fā)現(xiàn)，TLR4缺陷位點(diǎn)的C3H/HeJ小鼠不能清除實(shí)驗(yàn)性的UTI，可能是由于不能吸引中性粒細(xì)胞聚集到感染的膀胱部位，最終使患者成為一個(gè)ASB攜帶者。

總之，TLRs可控制微生物的致病性、激活宿主的黏膜防御、導(dǎo)致細(xì)菌清除，其表達(dá)水平及功能與宿主泌尿系感染的類型及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。對(duì)于尿路感染，目前抗菌藥物治療效果越來(lái)越不理想，調(diào)節(jié)尿道固有免疫系統(tǒng)功能可能成為新的策略，化學(xué)藥物結(jié)合“TLR免疫療法”(如發(fā)現(xiàn)或合成某種物質(zhì)上調(diào)TLRs的表達(dá)，或用抗TLRs特異性抗體、構(gòu)建TLR s缺失基因轉(zhuǎn)染相關(guān)細(xì)胞來(lái)提高機(jī)體對(duì)尿路致病菌的抵抗與清除能力)亦具有發(fā)展前景。

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