焦月華，樸成玉，嚴(yán) 妍，于 敏，賈博宇，周忠光

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，哈爾濱 150040）

黃酮類化合物屬于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在植物內(nèi)部大部分與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在，多存在于高等植物及羊齒類植物中，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的8 000多種黃酮類化合物存在于5 000多種植物中[1]。根據(jù)苯環(huán)間連接位置、氧化程度以及是否成環(huán)等將黃酮類化合物分為黃酮和黃酮醇類、二氫黃酮和二氫黃酮醇類、異黃酮和二氫異黃酮類、查爾酮和二氫查爾酮類、橙酮類、花色素和黃烷醇類以及其他黃酮類[2]。

黃酮類化合物具有降低血管脆性及異常的通透性、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓形成、抗肝臟病毒、抗炎、抗菌、解栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗癌、防癌、降血糖、鎮(zhèn)痛和免疫等生理活性[3-6]。這些生理活性已被關(guān)注，對(duì)該類化合物的研究成為醫(yī)藥界的熱門課題。人體自身不能合成黃酮類化合物而只能從食物中攝取，因此多年來(lái)科學(xué)家都在積極研究探討從植物體中分離純度高、活性強(qiáng)的黃酮類化合物[7]。

1 黃酮類化合物的提取

黃酮類化合物在花、葉、果等組織中多以苷元的形式存在，而在根部堅(jiān)硬組織中，則多以游離苷元形式存在。因此，不同來(lái)源、部位、種類黃酮提取所采取的方法不同[7]。分離黃酮類化合物的方法很多，根據(jù)黃酮類化合物與混入其他化合物的極性不同可采用溶劑萃取法，根據(jù)黃酮化合物在酸性水中難溶、堿性水中易溶的特點(diǎn)可采用堿提酸沉法，根據(jù)黃酮類化合物對(duì)不同物質(zhì)的解離性不同可采用離子交換法等。

1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是目前黃酮類化合物提取最常用的方法之一。其優(yōu)點(diǎn)是操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，去除雜質(zhì)效果較好，萃取后澄明度較高。溶劑萃取過(guò)程中不僅可以除去雜質(zhì)還可以起到分離苷和苷元或極性苷元與非極性苷元的效果。該方法的缺點(diǎn)是萃取過(guò)程中苷類物質(zhì)及其他有效成分會(huì)有部分損失，同時(shí)其他一些難溶于水的有效成分還可能在經(jīng)醇處理后沉淀，所以在處理前應(yīng)多次試驗(yàn)所用溶劑的種類和濃度。常用的溶劑系統(tǒng)有水-醋酸乙酯、正丁醇-石油醚等。

1.2 微波提取法

微波提取法是將微波與萃取相結(jié)合的一種方法。其基本原理是當(dāng)微波在傳輸過(guò)程中遇到不同的物質(zhì)，會(huì)根據(jù)該物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生反射、吸收和穿透現(xiàn)象，因此可以選擇性加熱待分離基體中欲提取組分所在的區(qū)域，從而將其從待分離基體或體系中分離提取，使之進(jìn)入提取劑[4]。具有回收率高、選擇性強(qiáng)、加熱快、節(jié)約能源、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。

1.3 超聲波法

超聲波提取技術(shù)的原理是利用超聲的空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械作用加速被提取成分的浸出，此外超聲波的次級(jí)效應(yīng)（化學(xué)效應(yīng)、攪拌作用、乳化作用）破壞細(xì)胞使其加速被提取成分的釋放、擴(kuò)散和溶解。與常規(guī)提取法相比，超聲波法的優(yōu)點(diǎn)比較突出，例如能獲得較高的產(chǎn)率且無(wú)需加熱、提取時(shí)間短等。

1.4 酶解法

當(dāng)恰當(dāng)?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧蠒r(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而減小有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散時(shí)細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)等屏障的傳質(zhì)阻力作用。雖然酶解法作用條件溫和，也有其局限性：酶有最適溫度和最適pH，所以酶解時(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)能夠較好的控制溫度和pH；酶解過(guò)程中可能會(huì)因?yàn)榕c某些成分發(fā)生反應(yīng)引起結(jié)構(gòu)變化而產(chǎn)生其他化學(xué)物質(zhì)，因此會(huì)影響產(chǎn)物的純度及收率[8]。

1.5 超臨界CO2萃取法

超臨界CO2萃取是一項(xiàng)萃取新技術(shù)，待分離的物質(zhì)在超臨界狀態(tài)下與超臨界流體接觸后，根據(jù)其極性、沸點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的不同，而依次被萃取、分離出來(lái)。超臨界CO2萃取法萃取率高且能最大限度保持提取物的天然特征、避免高溫、沒(méi)有有機(jī)溶劑殘留、生產(chǎn)周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到青睞[9]。但是超臨界CO2萃取的極性小，更適宜提取低分子、低極性、親脂性、低沸點(diǎn)的成分，而在提取相對(duì)分子質(zhì)量較大、極性集團(tuán)多的成分時(shí)需要加入合適的夾帶劑來(lái)改變?cè)谐煞值娜芙舛取A帶劑往往是具有很好溶解性能的溶劑，例如甲醇、丙酮等。

1.6 半仿生提取技術(shù)

半仿生提取法是整體藥物研究法與分子藥物研究法的整合，該方法模仿口服藥在胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，提取含待分離成分高的“活性混合物”，采用選定pH的酸性水和堿性水依次連續(xù)提取，因此該方法可以提取和保留更多的有效成分，并能降低成本、縮短生產(chǎn)周期，更適用于一些經(jīng)消化道給藥的中草藥制劑。

1.7 超速離心法

超速離心法常作為膜分離法的前處理工藝。工作原理是通過(guò)離心機(jī)離心加速度在超過(guò)重力加速度時(shí)能夠加速藥液中雜質(zhì)的沉淀從而將其除去。超速離心法的優(yōu)點(diǎn)是提取后的溶液中有效成分含量高，基本能將藥液充分回收，且操作省時(shí)、省力、澄明度高等。但該方法僅適用于分離不易沉降的懸浮液卻無(wú)法除去糖類及其他不易沉降的雜質(zhì)。

2 黃酮類化合物的分離

經(jīng)提取的黃酮類化合物僅僅是粗提物，含有其他雜質(zhì)混合物，而且混合有多種成分的黃酮類化合物，還需進(jìn)一步分離純化。常用分離方法有色譜法、硼酸絡(luò)合法、pH梯度萃取、分子烙印技術(shù)等。

2.1 色譜法

2.1.1 柱色譜

柱色譜分離黃酮類化合物常用的吸附劑或載體有硅膠、聚酰胺及纖維素粉等。硅膠柱色譜：色譜適用范圍廣，可用于多種類型的黃酮類化合物的分離；聚酰胺柱色譜：因聚酰胺富含酚羥基，可形成氫鍵締合產(chǎn)生吸附，適用于分離苷、苷元、查耳酮與二氫黃酮等各種類型的黃酮類化合物[10]。葡聚糖凝膠：用葡聚糖凝膠分離黃酮苷時(shí)，主要起分子篩的作用，在進(jìn)行洗脫時(shí)，黃酮苷類流出柱體的順序與相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān)，基本上是按照相對(duì)分子質(zhì)量從大到小依次流出；環(huán)糊精鍵合凝膠柱：β環(huán)糊精是一種同時(shí)具有多羥基外周和疏水空腔的圓筒形分子，黃酮類化合物能夠與環(huán)糊精配基同時(shí)生成氫鍵并發(fā)生疏水作用，從而為色譜分離過(guò)程提供保留力，譚天偉等利用環(huán)糊精鍵合凝膠介質(zhì)分離純化葛根素、表沒(méi)食子兒茶素以及槲皮素、山奈酚和異鼠李素，效果良好[11]。大孔樹(shù)脂吸附性能是由于范德華力或生成氫鍵的結(jié)果，在確定分離條件時(shí)，首先要選擇樹(shù)脂的孔徑，孔徑的選擇要參考被分離化合物分子體積的大小，其次要選擇樹(shù)脂的型號(hào)和分離條件，這要考慮分子中是否含有羧基、酚羥基或堿性氮原子等官能團(tuán)。大孔樹(shù)脂常用的洗脫劑有水、梯度乙醇、甲醇和丙酮等[12]。

2.1.2 加壓毛細(xì)管電色譜法

加壓毛細(xì)管電色譜是一種新型微分離分析技術(shù)，直流高壓電場(chǎng)加壓與填充有微細(xì)顆粒HPLC填料的毛細(xì)管電色譜柱兩端，大幅提高了樣品分離能力，該方法適用于復(fù)雜生物及化學(xué)體系的研究[13]。該方法中樣品在毛細(xì)管柱中的保留行為同時(shí)受到電滲流及其在流動(dòng)相與固定相之間分配系數(shù)的雙重影響，使分辨能力得到極大提高。Wang等利用加壓毛細(xì)管電色譜法（pCEC）來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥中黃酮類化合物的異同[14]。

2.1.3 薄層色譜

薄層色譜是一種快速、簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用廣泛的色譜分析方法。常規(guī)的薄層色譜法存在展開(kāi)時(shí)間長(zhǎng)、展開(kāi)劑體積需求大和分離結(jié)果差等缺點(diǎn)[15]。離心薄層色譜則可以替代制備型薄層色譜，有時(shí)甚至能替代柱色譜，分離速度快、處理量大[16]。張超等利用離心薄層色譜成功的從地菍中分離出槲皮素、廣寄生苷和山柰酚[17]。

2.1.4 高效制備液相色譜

高效制備液相色譜（HPLC）正相系統(tǒng)的固定相有硅膠柱和氨基柱，反相系統(tǒng)的固定相有C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱及C2柱等[18]。流動(dòng)相一般用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)，并加入少量的酸來(lái)改善分離效果，防止拖尾[19]。Biesaga等利用RP HPLCUV-MS監(jiān)測(cè)馬鈴薯成熟過(guò)程中某些黃酮類物質(zhì)含量的變化[20]。但因?yàn)槠涑杀颈冉?jīng)典柱色譜要高，因此多用于定性與定量分析或者少量物質(zhì)的純化。

2.1.5 高速逆流色譜分離法

高速逆流色譜分離法（HSCCC）是一種新的分離技術(shù)。其線圈中固定相不需要載體，因而清除了氣液色譜中由于使用載體而帶來(lái)的吸附現(xiàn)象，用于制備性分離時(shí)，每次進(jìn)樣體積較大，進(jìn)樣量也較多[9]。Yuan等提取木蝴蝶葉子中黃酮類化合物，經(jīng)HSCCC分離純化的效果很好[21]。

2.2 pH梯度萃取

pH梯度萃取法是分離酸性、堿性、兩性成分常用的手段。黃酮類化合物由于酚羥基的取代而顯酸性，因羥基的數(shù)目和位置不同，酸性強(qiáng)弱也不同。pH梯度萃取的原理是由于溶劑系統(tǒng)pH變化改變了其存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變了其在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。分離酸性強(qiáng)弱不同的黃酮類化合物，可用pH由低至高的堿性緩沖溶液順次萃取，使酸性由強(qiáng)到弱的黃酮類化合物分別萃取出來(lái)。

2.3 分子烙印技術(shù)

分子烙印技術(shù)是對(duì)特定目標(biāo)分子制備具有高選擇識(shí)別性能材料的技術(shù)[22-23]。分子烙印技術(shù)需要首先制作分子烙印聚合物介質(zhì)，這也是分子烙印技術(shù)的關(guān)鍵。通常制作聚合物介質(zhì)需要3個(gè)步驟，首先由聚合物單體溶液與將被分離的目標(biāo)分子形成復(fù)合物，再加入交聯(lián)劑使復(fù)合物產(chǎn)生聚合反應(yīng)，最后除去包埋在聚合物中的目標(biāo)分子，就得到分子烙印聚合物介質(zhì)。該介質(zhì)對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)具有記憶功能，當(dāng)再次遇到目標(biāo)分子時(shí)，聚合物便可進(jìn)行選擇性識(shí)別。按照單體與模板分子間形成復(fù)合物的作用力不同，分子烙印技術(shù)可分為共價(jià)型、非共價(jià)型和半共價(jià)型[11,16]。

2.4 雙水相提取

雙水相提取技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是兩相分相時(shí)間短，分相過(guò)程溫度低，操作簡(jiǎn)單，提取率高。同時(shí)因?yàn)镻EG及鹽類對(duì)人體和環(huán)境沒(méi)有毒害，所以雙水相提取被稱為黃酮化合物富集分離的有效方法之一。石慧等利用PEG400 25%和（NH4）2SO412%組成的雙水相體系萃取分離加楊葉中的總黃酮，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，萃取率＞95%，為黃酮類化合物萃取分離的一種有效方法[24]。

2.5 膜分離法

膜分離法是以濾膜為分離介質(zhì)，以壓力為推動(dòng)力，依靠膜的選擇性，將溶液中的混合物分成保留液與通過(guò)液兩部分，從而按相對(duì)分子質(zhì)量依次將各組分分離、純化、濃縮。根據(jù)孔徑不同分為微濾、超濾、納濾、反滲透等。膜分離是一種物理過(guò)程在常溫下操作，不需要發(fā)生相變化也不需要添加助劑，因而適于分離熱敏性、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的藥物[9]。超濾法（UF）介于微濾與納濾之間，通過(guò)控制超濾膜孔徑大小，能有效除去提取液中大分子物質(zhì)，但因目前膜材料的品種較少，膜孔徑分布范圍較寬而影響了分離性能。

3 結(jié)語(yǔ)

提取分離黃酮類化合物的方法很多，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出很多新方法和新設(shè)備，使提取分離效率不斷提高。目前在黃酮類化合物的提取方法中，一些傳統(tǒng)方法仍占主導(dǎo)地位，但也逐漸暴露出許多問(wèn)題，如能量消耗大、提取分離周期長(zhǎng)、溫度要求高、有效成分易被破壞、殘留的溶劑污染環(huán)境、浪費(fèi)資源等。一些新興技術(shù)如超濾技術(shù)、微波技術(shù)等具有能耗小、周期短、產(chǎn)率高、純度高、有利于保護(hù)有效成分不被破壞等特點(diǎn)而日益受到人們關(guān)注。黃酮類化合物提取的發(fā)展方向應(yīng)在優(yōu)化現(xiàn)有傳統(tǒng)提取工藝的同時(shí)，開(kāi)發(fā)、完善并普及新興技術(shù)。

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