唐 遠，王 超，陸永躍

(華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣州 510642)

Wolbachia是一種立克次氏體細菌，有立克次體的一般特征，其家族中的成員屬于Proteobacteria的α亞門，為革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于節(jié)肢動物體內(nèi)，已報道侵染了大約20%的昆蟲種類(Werren， 1997;Harrietand Henk， 2003)。Wolbachia隨母系遺傳，能在昆蟲的個體、群體間迅速進行橫向傳播，參與調(diào)控寄主的多種生殖活動，包括誘導生殖不親和、孤雌生殖、雌性化、殺雄性及增強雄性或雌性的生殖力等，近年來Wolbachia的功能、作用規(guī)律和機制等成為了國際生物學研究的熱點 (龔鵬等，2002;施婉君等，2002)。

目前確認昆蟲體內(nèi)是否感染W(wǎng)olbachia的方法是主要是檢測其細胞周期基因16S rDNA、23S rDNA、ftsZ和編碼Wolbachia表面蛋白的wsp基因(surface protein of Wolbachia) (龔鵬和沈佐銳，2002)。Zhou等 (1998)在wsp序列分析的基礎上，將沃爾巴克氏體細分為12個亞群(subgroup)，并設計了這12個亞群的wsp基因診斷的PCR擴增特異引物，建立了相對完善的沃爾巴克氏體wsp基因診斷技術(shù)。此后，在GenBank中登錄并獲得專利號的 wsp基因越來越豐富，為Wolbachia的研究提供了大量的資料。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于昆蟲 (龔鵬等，2002;孫曉等，2004)、蜘蛛 (楊啟偉等，2008)、螨類 (苗慧等，2004;Gotoh et al.，2005)等體內(nèi)Wolbachia的檢測。

扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley屬同翅目、粉蚧科，1898年在美國新墨西哥州首次發(fā)現(xiàn)并定名 (Tinsley，1898)。2005年該蟲在印度和巴基斯坦棉花上暴發(fā)成災，造成巨大經(jīng)濟損失，2006年兩國的旁遮普邦棉花均減產(chǎn)12%，2007年減產(chǎn)達到 40% (Dutt，2007;Hodgson et al.，2008)。2008年8月在我國廣州發(fā)現(xiàn)該蟲危害 (武三安和張潤志，2009;Lu et al.，2011)。由于它是棉花生產(chǎn)的潛在重要害蟲，2010年5月我國將扶桑綿粉蚧增列為全國農(nóng)業(yè)、林業(yè)植物檢疫性有害生物 (王琳和楊曉朱，2010)。該蟲寄主范圍廣，包括葫蘆科、豆科、茄科、唇形科、錦葵科、藜科等100多種植物，其中棉花、煙草、南瓜、番茄等是重要的經(jīng)濟作物 (Tinsley，1898;陸永躍等，2008;孫峰和陸永躍，2011)。風險分析結(jié)果顯示，該蟲對我國各大棉區(qū)棉花生產(chǎn)均存在巨大威脅 (王艷平等，2009)。因此，掌握該蟲生物學、生態(tài)學，研制有效的防治策略和技術(shù)十分必要。開展扶桑綿粉蚧體內(nèi)共生菌Wolbachia研究，對了解該蟲入侵種群生殖生物學變化、開發(fā)應用Wolbachia控制害蟲的新途徑等均具有重要意義。本文應用wsp基因診斷技術(shù)檢測了入侵我國的扶桑綿粉蚧種群中沃爾巴克氏體存在情況，首次發(fā)現(xiàn)了Wolbachia感染現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 扶桑綿粉蚧樣品及其保存

供試的扶桑綿粉蚧于2011年11月采自海南省?？谑?，采回來的粉蚧在室內(nèi)用扶桑進行連續(xù)飼養(yǎng)繁殖5代，獲得的雌成蟲以無水乙醇浸泡，保存于－40℃的低溫冰柜備用。

1.2 總DNA的提取

總DNA的提取在參照溫碩洋和何曉芳(2003)的方法并進行一些修改:取單頭雌成蟲放入1.5 mL的離心管，先加入6 μL的STE(100 mM NaCl;10 mM Tris － Cl，pH 8.0;1 mM EDTA，pH 8.0)，研磨勻漿，加入54 μL的STE來清洗研磨杵，再加入6 μL蛋白酶K(200 μg/mL)，研磨液在56℃恒溫器中消化2 h，消化后的產(chǎn)物在95℃孕育45 s，14000 r/min離心1 min沉淀殘渣，上清液作為做PCR的模板或保存在 －20℃冰箱中備用。

1.3 wsp基因擴增及電泳檢測

wsp基因的PCR擴增方法參照Zhou等 (1998)。擴增引物為:wsp81F(5'TGGTCCAATAAGT GATGAAGAAAC)和wsp 691R(5'AAAAATTAAACGCTACTCCA)，由上海生工科技有限公司合成。

擴增體積為25 μL:含模板DNA(扶桑綿粉蚧總DNA)1 μL，20 μmol/L正向引物和反向引物各 1 μL，2.5 mM dNTP 混合液 2 μL，5 U/μL Taq酶 (TaKaRa)0.2 μL，10×buffer(含鎂離子)2.5 μL，無菌雙蒸水 17.3 μL。

擴增條件:94℃預變性 4 min;94℃ 45 s;54℃45 s;72℃ 1 min;擴增35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴增反應結(jié)束后，取PCR特異性擴增產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測 (電壓72 V，電泳緩沖液為1×TAE)，紫外燈下觀察結(jié)果，以明確wsp基因的存在與否及擴增片段的大小。

1.4 wsp基因片段克隆及測序

用電泳凝膠回收試劑盒 (天根生化科技 (北京)有限公司生產(chǎn))對目的片段進行分離純化后，克隆到該公司的pGM－T載體中，篩選出陽性克隆，將轉(zhuǎn)化菌株送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，并在NCBI中進行序列比較。

2 結(jié)果與分析

特定基因區(qū)段的PCR特異性擴增已經(jīng)成為鑒定昆蟲體內(nèi)細菌共生的常規(guī)途徑。利用沃爾巴克氏體wsp基因的1對通用引物 (81F，691R)，成功地從扶桑綿粉蚧雌成蟲的總DNA中擴增到一段550 bp左右的wsp基因片段 (圖1)，并通過5次驗證。經(jīng)過測序分析，所得wsp基因序列實際長度為540 bp，具體序列見圖 2。將所得序列與GenBank中注冊的Wolbachia核苷酸序列進行同源性比較，同源性最高可達到99%，證明扶桑綿粉蚧雌成蟲體內(nèi)存在Wolbachia。

圖1 扶桑綿粉蚧沃爾巴克氏體wsp基因PCR特異性擴增片段 (約550bp)Fig.1 Specific amplified fragment of Wolbachia wsp by PCR in the solenopsis mealybug

圖2 扶桑綿粉蚧雌成蟲體內(nèi)沃爾巴克氏體wsp基因序列Fig.2 Wsp sequence of Wolbachia infecting the solenopsis mealybug female

3 結(jié)論與討論

本文的研究為入侵我國的扶桑綿粉蚧感染W(wǎng)olbachia提供了分子生物學依據(jù)，明確了Wolbachia對扶桑綿粉蚧的感染現(xiàn)象。通過對CABI、JCR、CNKI等文獻數(shù)據(jù)庫以及GenBank的檢索，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外對Wolbachia在粉蚧體內(nèi)的共生現(xiàn)象鮮有報道，僅Paul(2006)在著作中提及來自巴西的粉蚧 Phenacoccus herreni體內(nèi)檢測到Wolbachia的存在。因此本文關(guān)于在扶桑綿粉蚧體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Wolbachia共生的現(xiàn)象在國內(nèi)外尚屬首次。

扶桑綿粉蚧是我國近年來的一種新外來入侵害蟲，具有繁殖能力強，擴散迅速，危害嚴重的特點。兼營孤雌生殖、繁殖能力強成為其種群易擴散傳播并成災的有利因素之一 (Vennila et al.，2010)。由于不需與雄性個體交配，孤雌生殖個體更容易以少量種群進入新生境并建立種群。在新的寄主上不需要雄蟲的存在也能大量產(chǎn)卵，孵化出新的后代，進行新一輪的生殖和傳播。其特殊的繁殖方式和強繁殖能力加強了該蟲傳播和擴散的可能性和風險性。扶桑綿粉蚧的孤雌生殖可能與沃爾巴克氏體的共生有關(guān)，已證實沃爾巴克氏體參與至少40多個物種的孤雌生殖 (Stouthamer，1997)。未來的研究將進一步針對扶桑綿粉蚧的不同地理種群檢測其是否感染沃爾巴克氏體，明確我國扶桑綿粉蚧感染W(wǎng)olbachia的基本類群及在種群中的感染率，在此基礎上進一步進行抗生素處理試驗，以探究扶桑綿粉蚧的生殖方式與Wolbachia相關(guān)性，分析Wolbachia對我國扶桑綿粉蚧生殖活動的具體作用。

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