周俊琴，譚曉風(fēng)，劉美蘭，龍洪旭

（1.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004）

油桐是大戟科Euphorbiaceae油桐屬Vernicia植物，是我國特有而重要的經(jīng)濟(jì)林木，它與油茶、烏桕和核桃并稱為我國四大木本油料植物[1]。油桐種子的含油率高達(dá)50%～70%，它具有優(yōu)異的防水、防腐和絕緣等性能，是重要的工業(yè)油料[2-3]。

β-酮脂酯-CoA合酶（KCS）是植物體內(nèi)超長鏈脂肪酸及其衍生物第2步合成中最重要的脂肪酰-CoA延長酶，它以油酯-CoA（或C20∶1脂酸-CoA）和丙二酰-CoA為原料，合成C20∶1或C22∶1的β-酮脂酰-CoA[4]。超長鏈脂肪酸是生物體中碳原子數(shù)超過18碳的脂肪酸，這一類脂肪酸在生物體中具有廣泛而重要的生理功能，它們參與種子中甘油酯、生物膜膜脂和鞘脂的合成，同時為角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成提供前體物質(zhì)。角質(zhì)層是植物自我防護(hù)的最后一道屏障，對植物生長發(fā)育和適應(yīng)外界環(huán)境方面有著重要的作用[5]。目前，人們對脂肪酸延長酶基因的研究主要集中在β-酮脂酯-CoA合酶（KCS）基因的研究上。KCS基因家族主要存在于植物界中，且不同物種所具有的KCS基因家族成員的種類和數(shù)量都不完全相同。在擬南芥中，共有21個成員（KCS1～KCS21）[6]，其中，KCS1[7]、CER6（KCS6）[8-10]、FDH（KCS10）[11-12]和 FAE1[13-14]的功能已有報道。之后陸續(xù)分離得到西蒙德木KCS[15]、雷斯克勒KCS3[16]和苔蘚類植物地衣FAE2[7]。在油菜中，主要對種子油脂中參與VLCFAs合成相關(guān)的FAE1（KCS18）基因做了大量研究[17]。β-酮脂酯-CoA合酶是超長鏈脂肪酸合成第1步縮合反應(yīng)的限速酶，是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化合成的。為給使用生物技術(shù)定向調(diào)控油料作物油脂組成奠定基礎(chǔ)，對β-酮脂酯-CoA合酶基因進(jìn)行了克隆與序列分析研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

2012年8月底在湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)油桐試驗基地（國家油桐種質(zhì)資源保存庫）采集油桐種子，材料貯存于－80 ℃冰箱中。

1.1.2 試驗試劑

試驗所用試劑有：購自Invitrogen公司的PureLinkTM RNA Mini Kit；購自全式金公司的2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞；購自Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶；購自天根公司的引物合成及測序；引物合成及測序結(jié)果由華大基因完成，其它試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成

采用試劑盒加CTAB裂解和氯仿/異戊醇抽提的綜合方法提取油桐種子內(nèi)的總RNA，之后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TaKaRa 公司cDNA 合成試劑盒說明書完成得到1條鏈cDNA。

1.2.2 油桐KCS基因的克隆

從油桐種子轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得KCS的全長序列，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計的上游引物為：Vf_KCS-WF “GCAGAGCGTGAATCTCAA TAACT”；下游引物為：Vf_KCS-WR“CCAACT GATCTATCAAAGTACACTCCTC”。然后以油桐種子反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系及程序見Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真DNA聚合酶說明書。回收PCR產(chǎn)物并連接到pEASY-Blunt Simple平末端載體中，轉(zhuǎn)化Trans-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上篩選陽性，篩選的陽性克隆送華大基因公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

通過生物信息學(xué)軟件Vector NTI 10.3.0、GENDOC、MEGA5.10、UCSF Chimera對 油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因序列和測序結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測，并用在線軟件Clustalw2、ProtParam、SignalP4.1、TargetP 1.1 Server、ProtScale、TMpred Server、Mobyle portal、SOPMA 和EsyPred 3 Dwebserver 1.0全面剖析KCS基因的結(jié)構(gòu)與功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐種仁RNA的提取和KCS基因的克隆

對提取的油桐種仁RNA并電泳檢測其完整性，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，RNA沒有降解，且28S條帶較亮。隨后根據(jù) TaKaRa 公司cDNA 合成試劑盒說明書完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而得到第1條鏈cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

根據(jù)測序結(jié)果比對分析，Vf_KCS全長為 1 440 bp，見圖2。其中 5′UTR 長為 41 bp，3′UTR 長為 61 bp，CDS長為 1 338 bp，推測其編碼446個氨基酸。將Vf_KCS的CDS序列進(jìn)行BLASTX 分析后共搜索到100多條相似度很高的KCS同源序列，其中與葡萄、草莓、陸地棉的相似度達(dá)81%，與油茶、浙江紅山茶、黃瓜、鷹嘴豆的相似度為80%，與大豆、苜蓿、番茄的相似度為76%。因此可以判斷Vf_KCS的CDS為β-酮脂酯-CoA合酶基因。

圖1 油桐種仁RNA檢測Fig.1 RNA detection of Vernicia fordii seed

圖2 Vf_KCS的PCR擴(kuò)增檢測Fig.2 PCR ampli fi cation of Vf_KCS

2.2 油桐KCS蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 油桐KCS基因編碼蛋白的氨基酸序列分析

油桐KCS基因全長1 338 bp，編碼1個完整的開放閱讀框（ORF）。該基因編碼1個含446個氨基酸的核苷酸序列，是縮合酶超家族中的一員，由圖3可以看出該基因編碼的蛋白質(zhì)具有3個酶活性位點、6個產(chǎn)物結(jié)合位點、5個丙二酰-CoA結(jié)合位點和多個二聚體形成位點，以及類查爾酮合酶（CHS-like）高度同源區(qū)域。通過得到的油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因的氨基酸序列信息以及其它物種的同種基因的序列信息，可知Vf_KCS的氨基酸序列有3個高度保守區(qū)，序列分別為“PTPSLSAM”、“FGNTSSSS”、“GSGFKCNSAVW”；1個β-酮脂酯-CoA合酶基因的催化區(qū)域，其中半胱氨酸cys為其催化位點，序列為“GMGCSA”，具體位置見圖7。分析結(jié)果證實本研究克隆到了1條完整的油桐KCS基因序列。

2.2.2 油桐KCS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和疏水性/親水性的分析

利用在線ProtParam對KCS基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：Vf_KCS所形成的蛋白相對分子質(zhì)量為50.15 kDa；等電點為9.21；理論推導(dǎo)半衰期為30 h；編碼蛋白的原子組成分別為C2264H3552N622O627S20；不穩(wěn)定系數(shù)是33.88，由此說明這2個蛋白是穩(wěn)定性蛋白。

圖3 Vf_KCS蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果Fig.3 Analysis result of conserved domain of Vf_KCS protein

采用在線ProtScale分析預(yù)測Vf_KCS編碼蛋白的疏水性，參照其數(shù)字文本格式分析發(fā)現(xiàn)Vf_KCS有265個親水性氨基酸殘基和173疏水性氨基酸殘基，分別占總殘基數(shù)的60.5 %和39.5 %，編碼的氨基酸序列中親水性氨基酸、疏水性都均勻分布在整條肽鏈中，脂肪系數(shù)為94.44，總平均親水性為－0.035，綜合分析可推測Vf_KCS基因編碼的蛋白是親水性蛋白。

2.2.3 油桐KCS基因編碼蛋白的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)在線Mobyle portal對Vf_KCS進(jìn)行跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4顯示：Vf_KCS有2個跨膜域和3個疑似跨膜域，2個跨膜域的位置分別在整個序列的第17～37，300～320的氨基酸殘基，3個疑似跨膜域位置分別在整個序列的第138～158，168～188，220～240的氨基酸殘基。每個跨膜結(jié)構(gòu)域由20個氨基酸殘基組成的螺旋，同時該序列的跨膜蛋白N端位于細(xì)胞質(zhì)中，C端位于細(xì)胞膜外。

圖4 Vf_KCS 的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of transmembrane topology in Vf_KCS

2.2.4 油桐KCS基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

在線工具SOPMA 軟件預(yù)測分析Vf_KCS氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Vf_KCS氨基酸殘基組成為：α-螺旋（Hh）為 45.07%、β-折疊（Ee）為 15.25%、β-轉(zhuǎn) 角（Tt）為5.61%、隨機(jī)卷曲（Cc）為34.08%。并且可以推測α-螺旋最有可能的位置是3～35，60～ 70，106～ 120，185～ 195，245～255，283～ 300，307～ 322，349～ 359，364～372，383～393，415～423；β-折疊最有可能的位置是42～47，138～144，168～173，198～ 204，278～ 282，403～ 408，且 Vf_KCS的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主。

根據(jù)EsyPred3Dwebserver1.0在線軟件對Vf_KCS進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5，并利用本地軟件UCSF Chimera 進(jìn)行結(jié)構(gòu)如圖6分析顯示：Vf_KCS編碼蛋白由7個α螺旋和4個β折疊組成。從疏水表面立體圖可以看到酶的整個輪廓，其中橘黃色為α螺旋，占主要部分。

圖5 Vf_KCS帶狀立體模型Fig.5 Ribbons spatial model of Vf_KCS

圖6 Vf_KCS疏水表面立體模型Fig.6 Hydrophobic surface graphic model of Vf_KCS

2.3 油桐KCS基因氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將克隆得到的Vf_KCS的cDNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它物種的KCS基因所編碼的氨基酸通過在線軟件clustalw2和GENDOC進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖7所示；用軟件MEGA4.0構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖8）。結(jié)果顯示此類蛋白質(zhì)C端及中間區(qū)域保守性較高，如239～247，264～271，453～471，485～505等區(qū)段高度保守，N端保守性較差，N端物種之間的差異也比較大。同時，Vf_KCS與葡萄的KCS基因相似度最高達(dá)89.69 %，與其它植物的KCS基因所編碼的氨基酸同源性大多在 80 %以上，但從不同物種KCS種系進(jìn)化分析圖來看，Vf_KCS與擬南芥的親緣關(guān)系是最為接近。

3 結(jié)論與討論

β-酮脂酯-CoA合酶是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化超長鏈脂肪酸合成的第1步縮合反應(yīng)限速酶，在植物脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用，同時也是角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成的前體物質(zhì)。本文從基因辨別、蛋白質(zhì)的理化特性分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、序列比對、分子進(jìn)化等方面對油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，獲得了一些該

序列的相關(guān)數(shù)據(jù)和信息，如Vf_KCS的CDS長度為1 338 bp，編碼446個氨基酸，所形成的蛋白相對分子質(zhì)量分別為50.15 kDa，等電點為9.21；它有3個高度保守區(qū)為“PTPSLSAM”、“FGNTSSSS”、“GSGFKCNSAVW”和1個β-酮脂酯-CoA合酶基因的催化區(qū)域為“GMGCSA”，其中半胱氨酸cys為其催化位點；Vf_KCS存在2個跨膜域和3個疑似跨膜域，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主；與其它物種來源的β-酮脂酯-CoA合酶基因及其編碼序列具有高度的同源性，并且在結(jié)構(gòu)及特性上非常相符合，從而進(jìn)一步驗證了本試驗所得的基因為油桐的β-酮脂酯-CoA合酶基因全長cDNA，為以后的油桐β-酮脂酯-CoA合酶基因的研究工作提供了理論依據(jù)。下一步將通過各種試驗驗證該基因在油桐中的各種功能。

圖7 不同物種KCS氨基酸序列比對結(jié)果Fig.7 Amino acid sequences alignment in KCS from different species

圖8 不同物種KCS種系進(jìn)化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of KCS from different species

參考文獻(xiàn)：

[1] 譚曉風(fēng).油桐的生產(chǎn)現(xiàn)狀及其發(fā)展建議[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2006, 24(3): 62－64.

[2] 何 方,何 柏,王承南,等.油桐產(chǎn)品質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)制訂說明[J].經(jīng)濟(jì)林研究, 2005, 23(4): 118－122.

[3] 孫 穎,盧彰顯,李建安.中國油桐栽培利用與應(yīng)用基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究, 2007, 25(2): 84－87.

[4] Lassner MW, Lardizabal K, Metz JG.A jojobabeta-Ketoaeyl-CoA synthase cDNA Complements the canola fatty acid elongation mutation in transgenic plants[J].Plant Cell,1996,8(2):281－292.

[5] 倪 郁,郭彥軍.植物超長鏈脂肪酸及角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成相關(guān)酶基因研究現(xiàn)狀[J].遺傳,2008,30(5):561－567.

[6] Toubes J, Raffaele S, Bourdenx B,et al.The VLCFA elongase gene family inArabidopsis thaliana: phylogenetic analysis, 3D modelling and expression profiling[J].Plant Mol Biol, 2008,67(5): 547－266.

[7] Todd J, Post-Beittenmiller D, Jaworski JG.KCS1 encodes a fatty acid elongase β-ketoaeyl-CoA synthase affecting wax biosynihesis inArabidopsis thaliana[J].Plant J,1999,17(2):119-130.

[8] Hooker TS, Millar AA, Kunst L.Signi fi cance of the expression of the CER6 condensing enzyme for cuticular wax production inArabidopsis[J].Plant Physiol, 2002,129: 1568－1580.

[9] Fiebig A.Alterations in CER6, a gene identical to CUT1,differentially affect long-chain lipid content on the surface of pollen and stems[J].Plant Cell, 2000, 12:2001－2008.

[10] Millar AA, Clemens S, Zachgo S,et al.CUT1, anArabidopsis generequired for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility,encodes a very-long-chain fatty acid condensing enzyme[J].Plant Cell, 1999, 11(5): 825－838.

[11] Pruitt RE.FIDDLEHEAD, a gene required tosuppress epidermal cell interactions inArabidopsis, encodes a putative lipid biosynthetic enzyme[J].PNAS,2000, 97: 1311－1316.

[12] Yephremov A.Characterization of the FIDDLEHEAD gene ofArabidopsisreveals a link between adhesion response and cell differentiation in the epidermis[J].Plant Cell,1999,11:2187－2201.

[13] Millar AA, Kunst L.Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme[J].Plant J, 1997, 12(1): 121－131.

[14] James DW Jr, Lim E, Keller J,et al.Directed tagging of theArabidopsisfatty acid elongation 1 (FAE1) gene with the maize transposon activator[J].Plant Cell, 1995, 7(3): 309－319.

[15] Das S, Roseoe TJ, Delseny M,et al.Cloning and molecular charaeterization of the fatty acid elongase l (FAE1) gene from high and low erucic acid lines ofBrassica campestrisandBrassica oleraeea[J].Plant Sci, 2002, 162:245－250.

[16] Rossak M, Smith M, Kunst L.Expression of the FAEI gene and FAEI promoter aecivity in developing seeds ofArabidopsis thaliana[J].Plant Mol Biol, 2001, 46(6):717－725.

[17] 郭經(jīng)宇.甘藍(lán)型油菜脂肪酸延長酶1基因FAE1的克隆、載體構(gòu)建、原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因擬南芥的初步研究[D].成都:四川大學(xué),2006.