李玲 ，唐炎英 ，閔子揚(yáng) ，童龍 ，肖璐 ，李涵 ，孫小武 ，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙，410128；2.湖南省瓜類研究所）

葫蘆科作物包括黃瓜、南瓜、西瓜、西葫蘆等常見的蔬菜和瓜果，是世界上重要的食用植物科之一，其重要性僅次于禾本科、豆科和茄科作物。長期以來，西瓜常規(guī)育種周期長、工作量大、遺傳性狀不穩(wěn)定等因素在很大程度上限制了西瓜的育種進(jìn)程。單倍體經(jīng)自然或者人工加倍可得到純合二倍體，這對異花授粉作物和雜交后代來說意義非常重大。一方面，單倍體育種大大縮短了二倍體的純合時間，從而減少了育種年限；另一方面還能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，提高誘變育種效率以及合成育種新材料。但是，葫蘆科作物自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低，不能滿足育種工作的需要，所以研究者嘗試通過雄核和雌核離體培養(yǎng)兩個途徑來誘導(dǎo)單倍體。目前葫蘆科作物通過雄核離體培養(yǎng)生產(chǎn)單倍體難度較大，采用雌核離體培養(yǎng)（未授粉的胚珠或子房）來獲得單倍體植株，是在較短時間內(nèi)獲得高度純合二倍體快速且有效的方法。到目前為止，通過未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)在葫蘆科的黃瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、西葫蘆上已成功獲得了單倍體植株，這對于葫蘆科作物的育種有著十分重要的意義[1]。

1 未受精子房離體培養(yǎng)的國內(nèi)外研究進(jìn)展

未受精子房離體培養(yǎng)的目的就是為了得到單倍體植株，自1921年意大利植物學(xué)家Blakesly在自然界中發(fā)現(xiàn)曼陀羅的單倍體植株以來，許多研究者都想利用單倍體加倍獲得純系，從而達(dá)到迅速穩(wěn)定雜種的目的。未授粉子房的離體培養(yǎng)是獲得單倍體植株的有效途徑之一。20世紀(jì)50年代末就開始有人離體培養(yǎng)未授粉的子房，并試圖通過此途徑誘導(dǎo)單倍體，但是都沒有成功。直到1976年，San Noeum[2]首次報道在小麥未受精子房離體培養(yǎng)試驗(yàn)中獲得單倍體植株。此后，國外的育種工作者一直在研究單倍體育種并試圖完善其途徑，已經(jīng)在許多植物種類上成功得到單倍體并應(yīng)用于新品種的培育。國內(nèi)從20世紀(jì)70年代才開始進(jìn)行這方面的工作，直到80年代，我國的雌核離體培養(yǎng)研究出現(xiàn)了第一個高峰，并在水稻、小麥、大麥、玉米、煙草等作物上，獲得了單倍體及自然加倍的雙單倍體植株。在葫蘆科上，杜勝利[3]成功地在黃瓜未受精子房的離體培養(yǎng)研究上得到了單倍體植株，并已將研究應(yīng)用到黃瓜的新品種選育上。Gémesné等[4]利用未授粉子房離體培養(yǎng)成功獲得了單倍體植株。Ficcadenti等[5]運(yùn)用與Gémesné等相似的培養(yǎng)方法在甜瓜未受精子房離體培養(yǎng)中也獲得了單倍體植株。2009年，葛志東[6]在西葫蘆未受精子房的培養(yǎng)中也同樣得到了再生單倍體植株。迄今為止，雖然未受精子房的離體培養(yǎng)在一些植物中已獲得單倍體植株，但仍然有多種作物沒有突破，這一途徑也存在著許多問題，為了更好地將相關(guān)的研究成果應(yīng)用到育種工作中，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

2 影響西瓜未受精子房離體培養(yǎng)的主要因素

葫蘆科未授粉子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的影響因素很多，主要有供體植株的基因型、胚囊的發(fā)育時期、供體的生長季節(jié)、外植體的預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)、培養(yǎng)基及激素的添加和培養(yǎng)條件等。

2.1 基因型

供體植株的基因型是影響未受精子房胚胎發(fā)生的重要因素之一已被廣泛證實(shí)，有些植株的子房只對特定的培養(yǎng)基有反應(yīng)[7]。杜勝利[3]以生長在同一春大棚中的津春3號和津雜2號黃瓜品種為試材，同期取未受精子房在培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)津春3號的胚芽和愈傷誘導(dǎo)率均高于津雜2號。同樣裴曉利等[8]將9種不同基因型黃瓜的子房切片接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，得出各材料單倍體誘導(dǎo)率變化幅度為65.52%～93.33%。這可能因不同材料的未受精子房對離體培養(yǎng)的敏感度不同，因此，選擇合適的基因型是植物未授粉子房離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

2.2 胚囊發(fā)育時期

胚囊發(fā)育時期對胚狀體的誘導(dǎo)至關(guān)重要。許多研究表明，處于成熟胚囊期即開花當(dāng)天的未受精子房，其胚狀體誘導(dǎo)率、成苗率均最高[9，10]。這可能是花器內(nèi)源激素的水平在開花當(dāng)日達(dá)到較高水平的緣故。但在黃瓜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，開花前1～4 d的子房均可誘導(dǎo)獲得胚芽，但以開花前2～3 d的子房胚芽誘導(dǎo)率最高[11，12]；同樣，葛志東[6]和孫守如等[13]發(fā)現(xiàn)，開花前1 d的西葫蘆子房和胚珠已成熟或接近成熟，易于被誘導(dǎo)。故不能僅憑開花時間來判斷胚囊發(fā)育時期，因?yàn)榕吣野l(fā)育會因植株生長狀況及采花時期不同而不同，開花天數(shù)相同胚囊發(fā)育時期也不盡相同。

2.3 供體的生長季節(jié)

供體材料的生長季節(jié)對胚狀體的誘導(dǎo)有一定的影響，不同播期的材料其胚狀體發(fā)生頻率差異極顯著。盛慧[14]的試驗(yàn)表明，秋季生長的黃瓜材料誘導(dǎo)率要高于春季，且不易污染，冬季的誘導(dǎo)效果一般。同樣陳解放[9]在南瓜上也得出胚狀體發(fā)生和小苗的誘導(dǎo)集中在 7月中旬和8月中旬。Przyborowski等[15]也在黃瓜單倍體誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，春季材料的誘導(dǎo)率很低，僅是夏季材料誘導(dǎo)率的1/4。說明季節(jié)對未受精子房離體培養(yǎng)的影響是顯著的。

2.4 外植體的預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)

未受精子房接種之前采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行預(yù)處理，或在接種后進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)能夠提高其培養(yǎng)效果。

①低溫預(yù)處理 周林[16]將2個供試材料置于4℃低溫預(yù)處理24～96 h，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理72 h效果最好，2個材料誘導(dǎo)率分別達(dá)到了49.34%和60.57%。王文和[17]在試驗(yàn)中得出，4℃低溫處理2 d草莓離體誘導(dǎo)效果最佳，隨著時間延長誘導(dǎo)率緩慢下降。但是Gémesné等[4]發(fā)現(xiàn)，低溫預(yù)處理對黃瓜未受精子房的誘導(dǎo)效果不明顯，雖然低溫預(yù)處理廣泛用于葫蘆科、十字花科等作物的大孢子培養(yǎng)，但其作用機(jī)理仍無具體定論。

②高溫預(yù)培養(yǎng) 高溫預(yù)培養(yǎng)對于啟動雌核發(fā)育有相當(dāng)重要的作用，在有些材料上不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)就不能形成胚狀體[4]。徐靜[7]、郭永強(qiáng)[12]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，35℃黑暗熱激5 d對啟動西葫蘆雌核發(fā)育有積極的作用，胚珠轉(zhuǎn)綠的百分率可達(dá)90.5%。同樣，Gémesné等[4]在黃瓜上也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過35℃熱激處理效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)18.4%。這可能與子房在熱激前后的生理性狀不同有關(guān)。

2.5 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是雌核誘導(dǎo)單倍體過程中的重要影響因素，培養(yǎng)基的影響涉及到基本培養(yǎng)基的種類、碳源的種類及濃度、外源激素的種類及濃度等諸因素。

①基本培養(yǎng)基 目前未受精子房的離體培養(yǎng)多采用MS基本培養(yǎng)基或其改良型。韓麗華[18]在厚皮甜瓜試驗(yàn)中選用MS培養(yǎng)基獲得了單倍體植株。杜勝利[3]則選用了1/2 MS培養(yǎng)基對黃瓜未受精子房進(jìn)行培養(yǎng)，并成功獲得了單倍體植株。然而，Kantartzi等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基H和MS沒有明顯的區(qū)別。那么究竟用何種培養(yǎng)基，必須經(jīng)過充分的比較試驗(yàn)才能確定，很難一概而論。

②培養(yǎng)基中的添加物 a.激素?；九囵B(yǎng)基只有配合使用適當(dāng)?shù)耐庠醇に?，才能更好地誘導(dǎo)愈傷組織、胚狀體的形成以及芽、根的分化。有研究表明，培養(yǎng)基中不加任何外源激素不能誘導(dǎo)子房的膨大和雌核發(fā)育[20]。葛志東[6]以西葫蘆為對象研究了激素對未授粉子房離體培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，NAA、6-BA和 2，4-D是誘導(dǎo)雌核發(fā)育的3種理想的外源激素，以 3 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L NAA+1mg/L 6-BA的組合誘導(dǎo)效果最好。Li等[21]認(rèn)為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.03～0.07 mg/L的TDZ效果最佳，胚珠誘導(dǎo)率高達(dá)7.85%～12.14%。杜勝利[3]在黃瓜試驗(yàn)中也得出，在僅加細(xì)胞分裂素不加生長素的培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出更多正常的胚芽。所以在試驗(yàn)中我們應(yīng)該根據(jù)需要來選擇合適的激素及激素濃度。

b.活性炭?；钚蕴磕芪脚囵B(yǎng)基中的有害物質(zhì)，給胚珠和子房創(chuàng)造更好的發(fā)育環(huán)境。Van等[22]和Gürel等[23]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中未添加活性炭的甜菜誘導(dǎo)率很低。而周林[16]在西瓜試驗(yàn)中得到了相反的結(jié)果。這可能因?yàn)榛钚蕴康奈經(jīng)]有選擇性，在吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)的同時也吸附了一些大量、微量元素和其他有用成分。所以在實(shí)際操作中應(yīng)該嚴(yán)格控制活性炭使用量。

c.碳源。碳源不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。許多研究表明，3%～4%的蔗糖濃度適合未授粉子房的誘導(dǎo)[7]。在添加了40 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，西瓜未受精子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分別達(dá)到了47.34%和53.14%[16]。杜勝利[3]在蔗糖對黃瓜雌核發(fā)育影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在30 g/L蔗糖條件下效果最好。

d.AgNO3。韓麗華[18]首次將AgNO3應(yīng)用于厚皮甜瓜雌核離體誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)AgNO3濃度為80 mg/L時，胚狀體誘導(dǎo)率最高，為0.74%。裴曉利等[8]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加AgNO3能顯著提高黃瓜雌核發(fā)育啟動率。

2.6 培養(yǎng)條件

許多試驗(yàn)表明，培養(yǎng)溫度白天28℃左右，夜間25℃左右，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照16 h誘導(dǎo)率最高[16，23]。同樣楊穎[24]在西瓜上發(fā)現(xiàn)25℃暗培養(yǎng)4 d后再進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)效果最佳。而王璐等[25]在黃瓜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過25℃暗培養(yǎng)處理1 d，啟動雌核發(fā)育的反應(yīng)率最高，達(dá)91.3%。總之，各種培養(yǎng)條件對不同植物的離體雌核發(fā)育有著不同的影響，但在葫蘆科方面，大部分研究證明，前期暗培養(yǎng)約一周，后期采取恒光恒溫的培養(yǎng)方式效果最佳。

3 再生植株倍性鑒定及染色體加倍

3.1 再生植株的倍性鑒定

葫蘆科作物通過單倍體誘導(dǎo)獲得的再生植株，往往是既有單倍體也有雙單倍體，甚至還有混倍體的，因此有效的倍性鑒定是其進(jìn)一步應(yīng)用于育種的基礎(chǔ)。目前鑒定植株倍性的方法主要有：形態(tài)學(xué)鑒定法、染色體計數(shù)法、流式細(xì)胞儀鑒定法、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞鑒定法。

①形態(tài)學(xué)鑒定法 因單倍體植株在正常生長狀態(tài)下常比其二倍體弱小，所以利用形態(tài)學(xué)特征在幼苗期可以目測選出大部分單倍體。這種方法比較直觀、便捷，但是耗時長。

②染色體計數(shù)法 是確定植物染色體倍性最基本和最精確的一種方法，通常以根尖或子房為材料，通過顯微鏡觀察染色體數(shù)目來確定植株倍性。

③流式細(xì)胞儀鑒定法 是用特異的DNA熒光染料對細(xì)胞染色，然后測定樣品的熒光密度，熒光密度與DNA含量呈正比。這種方法快速、簡便、準(zhǔn)確，但是價格昂貴。楊穎[24]在西瓜未受精子房的離體培養(yǎng)的試驗(yàn)中利用流式細(xì)胞儀鑒定了再生植株的倍性。Gémesné等[4]在黃瓜研究中也利用流式細(xì)胞儀檢測到87.7%的再生植株為單倍體。

④氣孔保衛(wèi)細(xì)胞鑒定法 是依據(jù)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長度、葉綠體數(shù)目、單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)目等的不同進(jìn)行植株倍性鑒定。謝冰等[26]選用此方法初步確定了西葫蘆植株的倍性。

3.2 染色體加倍

單倍體植株只有加倍成純合的二倍體才能在實(shí)際育種中應(yīng)用。單倍體植株在生長發(fā)育過程中，可以自然加倍成雙單倍體，但是頻率一般比較低，而且加倍頻率受試材基因型的影響，所以需要采用人工加倍方法來滿足育種實(shí)踐的要求。到目前為止，大多數(shù)試驗(yàn)是利用秋水仙堿誘導(dǎo)單倍體。秋水仙堿處理方法有：浸漬法、涂抹法、滴液法等，其中浸漬法是主要的方法。杜勝利[3]采用秋水仙堿浸泡處理黃瓜植株后，其成活率大大提高，且變異率達(dá)33.3%和41.7%，加倍率為4.1%。

4 問題及展望

4.1 存在的問題

通過未受精子房的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體在很多物種中已得到應(yīng)用，但這種方法還不能普遍應(yīng)用在所有重要栽培作物中。特別是在西瓜未受精子房離體培養(yǎng)上，誘導(dǎo)體系還不完善，誘導(dǎo)率也不高。即使成功誘導(dǎo)出單倍體植株，也存在如何將誘導(dǎo)率穩(wěn)定下來，如何選擇最好的再生植株倍性鑒定方法及胚囊植株加倍方法等問題，所以還需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)研究。

4.2 展望

通過未受精子房的離體培養(yǎng)獲得單倍體，避免了育種工作中繁瑣的多代自交程序，能夠快速有效地獲得純合雙單倍體，并且可直接應(yīng)用于培育新品種或作為優(yōu)良親本應(yīng)用于品種改良，從而大大縮短育種年限；通過單倍體加倍可得到高度純合的雙單倍體，被認(rèn)為是研究分子標(biāo)記和基因圖譜的極好材料。同時在單倍體和雙單倍體中，所有隱性基因均處于純合狀態(tài)，可消除顯性基因的干擾。因此，西瓜未受精子房的離體培養(yǎng)技術(shù)在作物遺傳育種的理論和實(shí)踐研究中均具有廣闊的應(yīng)用前景。相信在不久的將來，西瓜未受精子房的離體培養(yǎng)技術(shù)能夠逐步完善，能為遺傳育種做出巨大貢獻(xiàn)。

[1]李建欣，龐淑敏，方貫?zāi)?瓜類作物單倍體育種研究進(jìn)展[J].中國瓜菜，2007（6）：36-39.

[2]San Noeum L H.Haploids d'Hordeum vulgard L.par culture in vitro non d'ovaires fecondes [J].Ann Amelior Plants,1976,26(4):751-754.

[3]杜勝利.黃瓜雌核發(fā)育及染色體倍性鑒定與加倍研究[D].天津：南開大學(xué)，2002.

[4]Gémes-Juhász A,Balogh P,Ferenczy A， et al.Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Plant Cell Reports,2002,21(2):105-111.

[5]FiccadentiN,SestiliS,Annibali S,etal.In vitro gynogenesis to induce haploid plants in melon Cucumis melo L.[J].Journal of Genetics and Breeding,1999,53:255-257.

[6]葛志東.西葫蘆未授粉子房離體培養(yǎng)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[7]徐靜.西葫蘆雌核離體高效培養(yǎng)體系的建立[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8]裴曉利，楊穎，李勝，等.黃瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46（6）：52-56.

[9]陳解放.南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)體系的優(yōu)化[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[10]謝冰，王秀峰，樊治成.西葫蘆離體雌核發(fā)育胚狀體成苗影響因子分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（5）：182-186.

[11]刁衛(wèi)平，陳勁楓，雷春，等.影響黃瓜未授粉子房培養(yǎng)胚發(fā)生因素的研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，31（1）：137-140.

[12]郭永強(qiáng).西葫蘆離體雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)單倍體的研究[D].北京：首都師范大學(xué)，2004.

[13]孫守如，翟慶慧，胡建斌，等.幾種生理因素對子房未授粉南瓜胚形成的影響[J].植物生理學(xué)通訊，2009，10（45）：977-980.

[14]盛慧.利用大孢子技術(shù)培育黃瓜單倍體的前期研究[J].種子科技，2011（8）：26-28.

[15]Przyborowski J,Niemirowicz-Szczytt K.Main factors affecting cumuber (Cucumis sativus L.)haploid embryo development and haploid plant characteristics[J].Plant Breeding,1994,112:70-75.

[16]周林.西瓜花藥、子房和子葉離體培養(yǎng)影響因素的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2009.

[17]王文和.未授粉子房和胚珠離體培養(yǎng)誘導(dǎo)植物雌核發(fā)育研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報，2005，22（增刊）：108-117.

[18]韓麗華.厚皮甜瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[20]Ferrant V,Bouharmont J.Origin of gynogenetic embryos of Beta vulgaris L.sexual plant[J].Reproduction,1994,7(1):12-16.

[19]Kantartzi S K,Roupakias D G.In vitro gynogenesis in cotton(Gossypium sp.)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2009,96(1):53-57.

[20]陳學(xué)軍，邢國明，陳竹君.西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)和植株再生[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000，12（3）：165-167.

[21]Li JW,Si SW,Cheng JY,et al.Thidiazuron and silver nitrate enhanced gynogenesis of unfertilized ovule cultures of Cucumis sativus[J].Biologia Plantarum,2013,57(1):164-168.

[22]Van Geyt J,Speckmann Jr JG,Halluin K D,etal.In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet(Beta Vulgaris L.)[J].Theoretical and Applied Genetics,1987,73(6):920-925.

[23]Gürel S,Gürel E,Kaya Z.Double haploid plant production from unpollinated ovules of sugar beet(Beta vulgaris L.)[J].Plant Cell Reports,2000,19(12):1 155-1 159.

[24]楊穎.西瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體與甜瓜SSR標(biāo)記圖譜構(gòu)建[D].銀川：寧夏大學(xué)，2010.

[25]王璐，陳小燕，張力.不同因素對黃瓜未受精子房胚狀體誘導(dǎo)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（4）：267-270.

[26]謝冰，王秀峰，樊治成.西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化及胚囊植株的產(chǎn)生[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（1）：132-138.