劉 曼，孫亭方，王貴林 （長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023）

止癢藥物的主要藥效學(xué)研究是對(duì)藥物的止癢作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性評(píng)價(jià)，目前最常用的評(píng)價(jià)方法是在瘙癢動(dòng)物模型上觀察單位時(shí)間內(nèi)的瘙癢次數(shù)及瘙癢潛伏時(shí)間等行為學(xué)表現(xiàn)。但瘙癢行為屬主觀指標(biāo)，其單獨(dú)應(yīng)用難以客觀評(píng)價(jià)藥物的止癢效果，常輔以其它指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)?，F(xiàn)對(duì)止癢藥物的藥效學(xué)研究概況作一綜述。

1 瘙癢動(dòng)物模型的建立

該模型的建立旨在探討?zhàn)W的病理生理機(jī)制和研發(fā)止癢藥物，目前瘙癢動(dòng)物模型主要有3類(lèi)［1］：①特定種系的自發(fā)瘙癢動(dòng)物模型。Matsuda等發(fā)現(xiàn)NC／Nga種系小鼠皮損與人類(lèi)特應(yīng)性皮炎相一致，它可以作為理想的皮炎動(dòng)物模型用于相關(guān)藥物研究；MRL／lpr種系小鼠因具有嚴(yán)重的自身免疫性疾病而自發(fā)表現(xiàn)出瘙抓行為，它可以作為模擬人類(lèi)某些自身免疫性疾病伴發(fā)瘙癢癥狀的理想動(dòng)物模型。②轉(zhuǎn)基因動(dòng)物瘙癢模型。該模型在研究瘙癢的發(fā)生機(jī)制方面應(yīng)用廣泛。③致敏物質(zhì)誘導(dǎo)的瘙癢動(dòng)物模型。該模型采用單一炎癥介質(zhì) （組胺、5－羥色胺、P物質(zhì)等）或?qū)⑵渑湮榻M合，通過(guò)皮內(nèi)或皮下注射引發(fā)動(dòng)物的瘙抓動(dòng)作，觀察并記錄單位時(shí)間的瘙抓次數(shù)；也可通過(guò)多種途徑方式給予化學(xué)物質(zhì) （如化合物48／80、4－氨基吡啶、右旋糖苷40、二硝基氟苯等）進(jìn)行致敏，從而引發(fā)動(dòng)物的瘙抓動(dòng)作。后者在誘發(fā)瘙癢的機(jī)制和作用效果上優(yōu)于直接使用外源性炎癥介質(zhì)，且更接近臨床，常用于止癢藥物的研究。

2 主要觀測(cè)指標(biāo)

2.1 單位時(shí)間內(nèi)瘙癢次數(shù)

早在1995年日本富山醫(yī)藥大學(xué)kuraishi博士研究組就已經(jīng)制備出小鼠的瘙癢動(dòng)物模型［2］，該模型采用皮下、皮內(nèi)或灌胃給藥等方式將致癢物質(zhì)注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，然后觀察記錄各實(shí)驗(yàn)小組小鼠在建模后一段時(shí)間的瘙抓行為。Oliveira等［3］分別采用化合物48／80和低分子右旋糖苷40作為致癢劑造模，在頸背側(cè)部位注射化合物48／80，以前、后爪撓鼻子和后爪撓注射部位為瘙癢標(biāo)準(zhǔn)，而注射低分子右旋糖苷40則以除了舔舐動(dòng)作外瘙抓全身作為一次瘙癢記錄。瘙癢次數(shù)因選擇的致癢劑不同或觀測(cè)者的主觀差異性使得瘙癢的標(biāo)準(zhǔn)難于統(tǒng)一。Jiang等［4］學(xué)者在每只實(shí)驗(yàn)小鼠后腿皮下植入小磁石，然后放入1個(gè)四周環(huán)繞著圓形線圈的觀察室里觀察，利用小鼠瘙抓時(shí)后腿動(dòng)作產(chǎn)生感應(yīng)電流的原理采用特殊儀器記錄，使觀測(cè)過(guò)程更簡(jiǎn)單、結(jié)果更準(zhǔn)確，但是對(duì)小鼠本身會(huì)造成一定傷害。新近發(fā)現(xiàn)的SCLABA－Real系統(tǒng)分析方法是一種比較客觀簡(jiǎn)易的無(wú)創(chuàng)性記錄分析方法，放置在觀察籠頂部的高速數(shù)字圖像采集系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)4只小鼠的行為進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)藥物組、模型組、對(duì)照組的瘙癢次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，可采用單因素方差分析法［3］，此法可以消除多組間比較時(shí)的抽樣誤差。

2.2 瘙抓反應(yīng)潛伏時(shí)間和單次瘙癢持續(xù)時(shí)間

采用攝像、計(jì)時(shí)器等儀器分別對(duì)藥物組和對(duì)照組造模后出現(xiàn)瘙癢反應(yīng)的潛伏時(shí)間以及單次瘙抓持續(xù)時(shí)間進(jìn)行記錄，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。這兩個(gè)指標(biāo)常結(jié)合單位時(shí)間內(nèi)瘙癢次數(shù)綜合評(píng)價(jià)受試藥物的止癢效果。吳春香等［5］等在研究地膚子醇提取物止癢效果時(shí)就使用上述方法和指標(biāo)。

2.3 致癢劑的致癢閾劑量

采用非定量給予致癢劑的方式造模，以致癢劑使用次數(shù)、致癢劑總量等指標(biāo)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最常采用磷酸組胺誘導(dǎo)的豚鼠瘙癢模型。王雪蘭等［6］在研究葎草水提取物止癢作用時(shí)先將涂藥后的各組豚鼠后肢用細(xì)砂紙輕輕擦傷，使之發(fā)紅，以不出血為度，然后于創(chuàng)面處滴0.25%組胺液，每隔3min滴1次，每次均為0.05ml／只，直至豚鼠出現(xiàn)舔后足為止，將豚鼠首次出現(xiàn)舔右后足時(shí)所給予的組胺總量為致癢閾劑量，以各組動(dòng)物的止癢閾劑量作為評(píng)價(jià)藥物止癢作用的指標(biāo)。吳春香等［5］采用該研究方法證實(shí)地膚子醇提取物的止癢作用；周然等［7］在蛇床子止癢成分R2的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中也采取涂藥后于后肢備皮處涂抹磷酸組胺，然后每隔3min以磷酸組胺濃度遞增方式給藥直至出現(xiàn)豚鼠回頭舔后足，并計(jì)算磷酸組胺的總量作為致癢閾劑量。

2.4 瘙癢介質(zhì)的測(cè)定

目前有關(guān)瘙癢發(fā)生的神經(jīng)生理機(jī)制尚未完全闡明，但是國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展。據(jù)報(bào)道［9］，傳導(dǎo)瘙癢的無(wú)髓鞘C纖維廣泛分布于皮膚真皮與表皮，外源性或內(nèi)源性因素作用于機(jī)體時(shí)可產(chǎn)生相應(yīng)的瘙癢介質(zhì)，后者與神經(jīng)末梢上的特異性受體結(jié)合而產(chǎn)生癢覺(jué)神經(jīng)沖動(dòng)。目前已確定的瘙癢介質(zhì)主要包括胺類(lèi)、蛋白酶、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)肽、類(lèi)阿片物質(zhì)、十二烷類(lèi)細(xì)胞素等。瘙癢介質(zhì)測(cè)定是研究藥物止癢作用的重要指標(biāo)。

2.4.1 胺類(lèi)介質(zhì) 胺類(lèi)介質(zhì)主要有組胺和5－羥色胺，組胺是目前研究最多的瘙癢介質(zhì)，組胺在體內(nèi)主要存在于嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞受到免疫性和非免疫因素作用時(shí)發(fā)生脫顆粒釋放組胺，后者與游離神經(jīng)末梢上的受體發(fā)生特異結(jié)合而引起癢覺(jué)傳導(dǎo)，但是它并不是所有疾病的瘙癢介質(zhì)［9］。致癢劑4－氨基吡啶誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)與刺激肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺有關(guān)［10］，此模型常被應(yīng)用于藥物止癢機(jī)制的探討。周然等［7］用此模型研究蛇床子的止癢作用，采用熒光法測(cè)定各組動(dòng)物皮膚和血清樣本的組胺含量，研究結(jié)果顯示藥物組的組胺含量明顯低于對(duì)照組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了蛇床子止癢有效成分的作用機(jī)理可能與其穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜、抑制皮膚肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺有關(guān)。

2.4.2 白細(xì)胞介素 業(yè)已證實(shí)白細(xì)胞介素IL－2、IL－4、IL－6能引起瘙癢反應(yīng)，在轉(zhuǎn)基因鼠中高表達(dá)IL－4可引發(fā)類(lèi)似人類(lèi)特異性皮炎的瘙癢性皮膚病［9，11］。我國(guó)學(xué)者王暉等［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯(lián)用建立瘙癢動(dòng)物模型，小鼠眼球取血用試劑盒測(cè)定小鼠血清中組胺、INF－γ和IL－6的濃度綜合作為評(píng)判模型優(yōu)劣的指標(biāo)之一，結(jié)果表明，瘙癢次數(shù)多的實(shí)驗(yàn)組血清中上述介質(zhì)濃度顯著高于瘙癢次數(shù)少的實(shí)驗(yàn)組。巫冠中等［12］在探討黃酮類(lèi)活性組分的止癢活性時(shí)用氯喹給小鼠全身造模后取各組小鼠血清樣本，用免疫組化方法測(cè)定IL－4含量，結(jié)果證實(shí)藥物組的IL－4的含量低于模型組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.3 其它介質(zhì) P物質(zhì)、INF－γ、TNF－α等亦可作為瘙癢介質(zhì)。P物質(zhì)是一種含11個(gè)氨基酸殘基的多聚肽，屬于速激肽家族，存在于神經(jīng)末梢纖維內(nèi)，與NK－1受體結(jié)合而引起癢覺(jué)傳導(dǎo)。多位學(xué)者［13－15］曾報(bào)道，在變應(yīng)性接觸性皮炎 （ACD）伴發(fā)的瘙癢機(jī)制研究中組胺和5－羥色胺可能不起主要作用，P物質(zhì)通過(guò)與神經(jīng)肽受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在其它類(lèi)型瘙癢中，C類(lèi)神經(jīng)被激活后可導(dǎo)致神經(jīng)肽P物質(zhì)的釋放，后者加速肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺。

2.5 病理形態(tài)學(xué)檢查

在瘙癢動(dòng)物模型觀察瘙癢行為之后，立即剪取模型小鼠注射致癢劑周?chē)?cm×2cm大小面積的皮膚，初步去除皮下結(jié)締組織，放入10%的甲醛溶液中固定保存，然后制成常規(guī)病理切片。瘙癢反應(yīng)的病理學(xué)改變主要有：局部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，毛細(xì)血管通透性增加以及炎性成分的滲出，炎性細(xì)胞的聚集、增生與浸潤(rùn)。

王暉［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯(lián)用建立瘙癢動(dòng)物模型，在該模型動(dòng)物皮膚樣本中發(fā)現(xiàn)以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞分布更密集，間質(zhì)水腫更明顯，結(jié)合瘙癢反應(yīng)次數(shù)及致癢介質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果綜合判斷，表明聯(lián)合方案建立的動(dòng)物模型瘙癢行為更明顯。

巫冠中［12］研黃銅類(lèi)止癢活性，探討該藥物抑制肥大細(xì)胞脫顆粒和組胺釋放的作用。選用SD小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)腹腔灌洗收集肥大細(xì)胞，并按相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)方法經(jīng)系列處理得到濃縮的單層細(xì)胞液，隨機(jī)收取100個(gè)細(xì)胞用1%中性紅溶液染色，計(jì)數(shù)其中脫顆粒的肥大細(xì)胞。評(píng)判的標(biāo)準(zhǔn)包括細(xì)胞邊緣的完整性消失；細(xì)胞顆粒狀物的釋放。

3 超敏反應(yīng)動(dòng)物模型在止癢藥物研究中的應(yīng)用

超敏反應(yīng)動(dòng)物模型的炎癥反應(yīng)程度可用于評(píng)價(jià)藥物止癢效果，在超敏反應(yīng)動(dòng)物模型上測(cè)定藥物組與對(duì)照組的局部腫脹度或單位面積重量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。周然等［7］將實(shí)驗(yàn)組涂藥、對(duì)照組涂賦形劑后用DNCB（2、4－二硝基氯苯）引發(fā)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，各組小鼠以1%DNCB（空白對(duì)照組用乙醇）0.1ml均勻涂于脫毛區(qū)皮膚致敏，次日起各組背部脫毛區(qū)涂抹相應(yīng)的藥物，1次／d，連續(xù)5d，于致敏后第5天，各組小鼠以1%DNCB 0.1ml均勻涂于右耳內(nèi)外兩側(cè)以激發(fā)，24h后脫臼處死，用打孔器取下兩耳相同部位相同面積的耳片稱(chēng)重，以左右耳片重量差值為腫脹度，計(jì)算出腫脹率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明給藥組的腫脹率明顯低于對(duì)照組。王雪蘭［6］亦采用該方法探討葎草水提取物的止癢效果。

4 小結(jié)與展望

止癢藥物藥理作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段常以瘙癢行為為主要甚至為唯一指標(biāo)。但在動(dòng)物瘙癢行為的觀察上因瘙癢行為的標(biāo)準(zhǔn)難于統(tǒng)一導(dǎo)致主觀上的誤差，同時(shí)也有客觀上的誤差，如以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象，小鼠在安靜無(wú)刺激因素的狀態(tài)下出現(xiàn)自發(fā)性的瘙癢行為動(dòng)作也較常見(jiàn)［15］。甚至有的學(xué)者建立的動(dòng)物模型本身就不能很好的模擬人類(lèi)的瘙癢癥狀［1］，kuraishi經(jīng)典的瘙癢模型就不能很好的區(qū)分疼痛和瘙癢引起的瘙抓動(dòng)作［16］。我們總結(jié)了評(píng)價(jià)藥物止癢效果的常用方法與指標(biāo)，具體使用時(shí)應(yīng)以瘙癢動(dòng)物模型的瘙癢行為記錄為基礎(chǔ)，再聯(lián)用其它方法與指標(biāo)。鑒于瘙癢往往是多因素引起的多種瘙癢介質(zhì)參與的病理癥狀，有學(xué)者在建立瘙癢動(dòng)物模型時(shí)同時(shí)采用幾種致癢物質(zhì)建立動(dòng)物模型而非單一物質(zhì)制造的動(dòng)物模型似乎更合理［10］。