王秀麗 張秀香
根據(jù)IDF 2007年第3版Diabetes Atlas統(tǒng)計中國糖尿病患者人數(shù)已達3 980萬,預(yù)計2025年將達到5 930萬[1],大約1/3的糖尿病患者最終發(fā)展為糖尿病腎病(DN)[2],DN引發(fā)終末期腎功能衰竭(ESRD)已成為糖尿病患者主要死因[3]。因此對DN進行早期干預(yù)非常重要。蛋白尿作為一項獨立危險因素,已經(jīng)成為DN進展的一項重要病理特征,臨床研究和動物實驗[4-6]表明腎臟足細胞(podocyte)的病變是導(dǎo)致蛋白尿的主要原因,包括足細胞肥大,足突缺失、融合,以及足細胞從基底膜的分離和凋亡,上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化等。而腎組織nephrin蛋白的表達水平變化與足細胞的病變密切相關(guān)[7-9],本研究在糖尿病大鼠模型基礎(chǔ)上,根據(jù)纈沙坦與貝那普利不同的藥理機制,對DN進行聯(lián)合干預(yù)觀察大鼠nephrin表達的變化,同時觀察腎組織病理變化,探討纈沙坦與貝那普利聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病腎病的作用機制及治療優(yōu)勢。
1.1 材料 雄性SD大鼠24只,體重(200±20)g,普通級,由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供;鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司),鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司,10 mg/片),纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司,80 mg/粒)。
1.2 DN模型建立及分組 將24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組(NC組)、糖尿病組(DN組)、纈沙坦與貝那普利聯(lián)合干預(yù)組(CT組),每組8只。DN、CT組以10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉,行左腎摘除術(shù)。
1.3 方法 常規(guī)消毒,背部切口1~1.5 cm,暴露左腎,剝離腎臟脂肪及腎上腺,結(jié)扎左腎門血管,切除左腎,縫合切口。術(shù)后1周,按體重給予STZ 55 mg/kg(溶解在0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中,pH值4.2)一次性腹腔注射建立DM大鼠模型(血糖>16.7 mmol/L,尿糖 +++ ~ ++++),NC 組予等量枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。成模后第2天開始,CT組給予鹽酸貝那普利 10 mg·kg-1·d-1和纈沙坦 10 mg·kg-1·d-1混懸液灌胃,NC、DN組給予等量0.9%氯化鈉溶液。實驗期間所有大鼠均自由飲水及進食,不給予胰島素及其他任何降糖藥物,8周后處死。
1.4 標(biāo)本收集及指標(biāo)測定 觀察指標(biāo):于實驗前及實驗第8周測定并記錄各組大鼠體重。腎臟病理:第8周末麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血處死大鼠后留取部分右腎組織采用10%中性甲醛固定,行免疫組織化學(xué)染色,同時將部分腎皮質(zhì)切成1 mm的立方小塊,2.5%戊二醛固定,用來制作超薄切片,并在鉛鈾雙染色后在日產(chǎn)JEM-1230型透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟病理變化;免疫組織化學(xué)檢測:所有待檢測標(biāo)本以10%甲醛固定,石蠟包埋,制成厚4 μm的切片,采用Elivision法檢測腎組織中nephrin的表達。切片脫蠟后加3%H2O2去離子水滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性,液微波修復(fù),3%過氧化氫孵育,滴加兔抗大鼠nephrin抗體(博奧森試劑公司),4℃過夜,依次滴加聚合物增強劑(試劑A)和酶標(biāo)抗兔聚合物(試劑B),滴加DAB顯色劑(以上試劑均屬福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司),鏡下控制顯色時間,之后蘇木精輕度復(fù)染細胞核,藍化、脫水、透明,中性樹膠封片。nephrin表達采用半定量分析,即隨機選取10個連續(xù)不重復(fù)的視野(×200),根據(jù)腎小球足細胞著色情況計算陽性指數(shù)(PI):陽性信號面積×陽性強度,求和、取平均數(shù)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 3組大鼠nephrin表達陽性指數(shù)情況 與NC組(5.9±0.7)比較,DN 組(2.1 ±0.3)nephrin表達明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.40,P<0.01);CT 組(5.0 ±0.7)表達輕度下調(diào),下調(diào)程度低于NC組正常值(t=2.53,P<0.05),但明顯高于 DN 組(t=10.60,P<0.01)。
2.2 免疫組化情況 NC組大鼠腎小球基底膜上,可見nephrin正常線性分布,nephrin蛋白特異性的表達在腎小球基底膜足突細胞上,腎小管中也有少量表達;DN組大鼠腎小球基底膜nephrin呈顆粒狀分布,顏色變淺;CT組腎小球基底膜nephrin呈斑點/線狀分布。見圖1。
2.3 電鏡情況 NC組腎小球結(jié)構(gòu)清晰,基底膜均勻一致,基本無足突細胞融合。DM組腎小球毛細血管基底膜厚薄不均,總體呈明顯增厚,結(jié)構(gòu)模糊不清,足突破壞、融合、部分脫落,系膜基質(zhì)增多、腫脹,系膜區(qū)基質(zhì)增生,可見少量電子致密物質(zhì)沉積。CT組基底膜基本均勻,無明顯增厚,足突細胞寬度變小、足突融合率降低。足突細胞數(shù)基本恢復(fù)正常,僅有少量足突細胞融合,系膜區(qū)基質(zhì)輕度增生。見圖2。
圖1 3組大鼠nephrin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(Elivision×200)
圖2 3組大鼠腎足細胞電鏡結(jié)果(鈾鉛染色×6 000)
DN的發(fā)生主要與腎小球的濾過障礙相關(guān),位于腎小球基底膜(GBM)外側(cè)的足細胞的足突相互交替形成裂孔構(gòu)成足突間裂孔隔膜,是蛋白質(zhì)丟失的最后屏障。足細胞nephrin蛋白是一種由1 241個氨基酸組成的跨膜糖蛋白,屬于細胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族成員,是裂孔隔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個跨膜蛋白,由足細胞表達、構(gòu)成裂孔隔膜拉鏈樣結(jié)構(gòu),與podocin、CD2AP組成復(fù)合體,維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整,阻止蛋白濾出。nephrin作為足細胞裂隙膜的關(guān)鍵組成成分,對高度特異性的足細胞功能起到關(guān)鍵作用,能通過介導(dǎo)上皮細胞與基質(zhì)的相互作用影響GBM的通透性和基質(zhì)的沉積,影響腎臟濾過膜結(jié)構(gòu)與屏障功能完整性。本研究發(fā)現(xiàn),DN動物模型觀察8周后nephrin表達明顯下調(diào),形態(tài)學(xué)顯示呈顆粒狀減少,同時電鏡示基底膜足細胞受損,而CT組經(jīng)纈沙坦與貝那普利聯(lián)合干預(yù)8周后nephrin表達上調(diào),免疫組化顯示nephrin呈斑點/線狀恢復(fù)過程,電鏡示基底膜足細胞大致恢復(fù)正常。這一結(jié)果與纈沙坦和貝那普利各自作用機制及DN發(fā)病過程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin.angiotensin system,RAS)過度激活相關(guān)[10],作為 RAS重要成員的血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,ANGⅡ)、血管緊張素Ⅱ受體(angiotensinⅡ type receptor,ATR)在RAS中最具生物活性,ANGⅡ通過對足細胞裂孔膜上具有重要生理功能的蛋白nephrin表達的調(diào)節(jié)導(dǎo)致足細胞受損,增加尿蛋白排泄;RT-PCR技術(shù)證明分化的人腎臟足細胞上有大量ATR1表達[11];貝那普利為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥,抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE),阻止血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ,從而減低由血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的一切作用;纈沙坦是一種特異性的血管緊張素Ⅱ(AT1)受體拮抗劑,它選擇性地作用于AT1受體亞型,阻斷ANGⅡ與AT1受體的結(jié)合。眾多研究對兩種藥物對DN的療效已有確切報道[12,13],但對兩藥聯(lián)合應(yīng)用對DN的干預(yù)報道少見,本研究在RAS對nephrin表達影響致DN發(fā)病機制基礎(chǔ)上,利用纈沙坦與貝那普利不同的藥理特點對DN大鼠模型進行聯(lián)合干預(yù),成功調(diào)節(jié)了nephrin的表達,恢復(fù)腎小球足細胞功能形態(tài),從而更有效的改善DN癥狀,延緩DN進展。
1 楊明功,陳明衛(wèi).預(yù)防為主,規(guī)范診療,安全達標(biāo)的糖尿病防治理念.國際內(nèi)分泌代謝雜志,2009,29:73.
2 Wild S,Roglic G,Green A,et al.Global prevalence of diabetes:estimates for the year 2000 and projections for 2030.Diabetes Care,2004,27:1047-1053.
3 劉新民,潘長玉,張達青,等主編.實用內(nèi)分泌學(xué).第1版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2004.1459-1053.
4 Teiken JM,Audettey JL,Laturnus DI,et al.Podocyte loss in aging OVE26 diabetic mice.Anat Rec(Hoboken),2008,291:114-121.
5 邢燕,葉山東.足細胞與糖尿病腎病關(guān)系的若干研究進展.國際老年醫(yī)學(xué)雜志,2001,32:39-43.
6 呂偉,齊棟.足細胞凋亡在糖尿病腎病發(fā)病中的作用.醫(yī)學(xué)綜述,2010,16,269-271.
7 Sheerin NS.A novel role for nephrin in the maintenance of glomerular structure.J Am Soc Nephrol,2009,20:1661-1663.
8 匡蕾.Nephrin與糖尿病腎病的關(guān)系.國際病理科學(xué)與臨床雜志,2011,31:139-143.
9 White KE,Bilous RW.Diabiopsies Study Group.Structural alterations to the podocyte are related to proteinuria in type 2 diabetic patients.Nephrol Dial Transplant,2004,19:1437.
10 邵德翠,陸利民.腎素-血管緊張素系統(tǒng)在糖尿病腎病腎臟足細胞損傷中的作用.生理科學(xué)進展,2011,42:246-250.
11 Liebau MC,Lang D,Bohm J,et al.Functional expression of the renninangiotensin system in human podocytes.Am J Physiol Renal Physiol,2006,290:710-719.
12 Kalaitzidis R,Bakris GL.Effects of angiotensin receptor block-ers on diabetic nephropathy.J Hypertens Suppl,2009,27:15-21.
13 Davi SB,Dei CA,Long DA,et al,Podocyte-specific expression of angiopoietin-2 causes proteinuria and apoptosis of glomerular endothelia.J Am Soc Nephrol,2007,18:2320-2329.