張玉果 趙素賢 李建梅 任偉光 李亞 南月敏
前期動物實驗表明扶正化瘀方可提高大鼠肝大部切除后24 h的肝再生速度。本實驗擬進一步驗證扶正化瘀方對大鼠肝再生的影響,采用大鼠肝大部切除(partial hepatectomy,PH)肝再生模型,以促肝細胞生長素(hepatocyte growth promoting factors,pHGF)為陽性對照藥物,研究扶正化瘀方對大鼠肝大部切除后72 h cyclinD1和肝再生的影響,探討扶正化瘀方促進肝再生的可能作用機制。
1.1 動物與試劑 清潔級雄性Wistar大鼠24只,體重240~280 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部(合格證號:1201030)。扶正化瘀方藥液為由上海黃海制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的扶正化瘀膠囊用蒸餾水配制成75 g/L。促肝細胞生長素(pHGF)購自長春富春制藥有限公司,批號 H20058141。兔抗人cyclinD1單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。GAPDH、cyclinD1引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司。
GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',GAPDH下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3';cyclinD1上游引物:5'-GCACAACGCACTTTCTTTCC-3',cyclinD1下游引物:5'-TCCAGAAGGGCTTCAATCTG-3'。
1.2 動物分組 將雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(對照組)、模型(PH)組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組,每組6只。于實驗前3 d至實驗結(jié)束,扶正化瘀組給予扶正化瘀藥液灌胃1 ml/100 g,pHGF組給予腹腔注射pHGF 1 ml/100 g,對照組、模型組均給予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g,1次/d。
1.3 造模方法 大鼠自由喂養(yǎng)1周后,術(shù)前12 h禁食,術(shù)前6 h禁飲,按照秦建民等[1]介紹的方法在無菌條件下操作,用1%戊巴比妥鈉(用量40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,在大鼠上腹部做一個縱形長約1 cm的切口,暴露左葉和中葉,在其根部結(jié)扎,切除肝臟左葉和中葉(占70%),術(shù)畢皮下給予0.9%氯化鈉溶液1 ml,縫合切口,消毒。對照組大鼠僅切開腹腔暴露出肝左葉和中葉,隨后送入腹腔,術(shù)后自由飲食物和水,術(shù)后72 h處死動物,切取全部再生肝組織,稱取濕重。取相同部位肝組織(1.0 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)兩塊,一塊以10%甲醛溶液固定,用于肝組織學(xué)觀察和免疫組化染色,另塊置于5 ml凍存管立即放入-80℃冰箱保存用于肝組織總RNA提取。
1.4 指標檢測
1.4.1 肝臟再生速度:[C -(A -B)/A]×100%,A=B/0.7,即估計全肝重;B=PH時切除的肝葉濕重;C=處死動物時再生肝臟濕重。
1.4.2 肝組織學(xué)檢查:取肝組織經(jīng)10%甲醛固定24 h后,常規(guī)脫水、石蠟包埋,連續(xù)切片(厚約4 μm),經(jīng)蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。有絲分裂指數(shù):每份標本隨機選取400×視野10個,應(yīng)用Image-Pro 5.0圖像分析軟件計算每個視野中有絲分裂肝細胞數(shù)占肝細胞總數(shù)的比例。cyclinD1免疫組化染色并結(jié)合圖像半定量分析計算肝細胞核陽性率。
1.4.3 肝組織cyclinD1 mRNA的表達情況:采用熒光定量RTPCR檢測。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多個樣本均值間兩兩比較用q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 動物的一般情況 假手術(shù)組PH術(shù)后1~2 h即可自由飲水、進食,實驗結(jié)束時解剖肝臟如正常肝臟鮮紅色。PH組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組術(shù)后1~2 h清醒,活動力差,需協(xié)助飲水,4~6 h后可自由飲水、進食。4組手術(shù)及術(shù)后死亡率均為0。
2.2 肝臟再生速度 與PH組比較,PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝再生速度顯著升高(P<0.05),而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表14組PH后72 h肝再生速度n=6,%,±s
表14組PH后72 h肝再生速度n=6,%,±s
注:與PH組比較,*P <0.05
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2.3 肝組織學(xué)觀察
2.3.1 一般形態(tài)學(xué)觀察:正常肝小葉肝細胞板排列有序,多為單排,以中央靜脈為中心呈放射狀,肝細胞大小較一致,少數(shù)雙核肝細胞,很少見核分裂(圖1)。PH后72 h肝細胞板部分呈雙排,肝細胞明顯增大,肝細胞及核大小不一,小葉中間帶可見多數(shù)雙核肝細胞及有絲分裂,間質(zhì)細胞反應(yīng)活躍(圖2)。
圖1 正常肝小葉肝細胞板多為單排,以中央靜脈為中心呈放射狀,很少見核分裂(HE×40)
圖2 PH后72 h肝細胞板部分呈雙排,可見多數(shù)雙核肝細胞(細箭頭)及有絲分裂(粗箭頭),間質(zhì)細胞反應(yīng)活躍(HE×40)
2.3.2 有絲分裂指數(shù):假手術(shù)組很少見到有絲分裂,與假手術(shù)組比較,PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組PH術(shù)后3 d有絲分裂指數(shù)顯著升高(P<0.05),與PH組比較,PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組有絲分裂指數(shù)顯著升高(P均<0.05),而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 PH術(shù)后72 h 4組有絲分裂指數(shù)n=6,%,±s
表2 PH術(shù)后72 h 4組有絲分裂指數(shù)n=6,%,±s
注:與假手術(shù)組比較,*P <0.05;與PH組比較,#P <0.05
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2.3.3 cyclinD1免疫組化染色:與假手術(shù)組比較,PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P<0.05);與PH組比較,PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P均<0.05),而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
表3 PH術(shù)后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6,%,±s
表3 PH術(shù)后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6,%,±s
注:與假手術(shù)組比較,*P <0.05;與PH組比較,#P <0.05
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2.4 肝組織cyclinD1 mRNA的表達 與假手術(shù)組比較,PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均<0.05);與PH組比較,PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均<0.05),PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。
表4 PH術(shù)后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6,±s
表4 PH術(shù)后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6,±s
注:與假手術(shù)組比較,*P <0.05;與PH組比較,#P <0.05
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肝臟再生是一個包括多種細胞增殖,是由多條通路、多種因素共同參與的一種復(fù)雜而又精確的生理過程,最終達到肝組織結(jié)構(gòu)的重建及肝功能恢復(fù)。近期研究認為一些因素包括因子、藥物等可影響肝臟再生[2,3]。扶正化瘀方由丹參、蟲草菌絲、桃仁、五味子、松花粉和絞股藍等六味中藥組成,既往研究多注重于其抗纖維化作用,對肝再生的影響尚無實驗依據(jù)。本研究以肝再生增殖階段重要的細胞因子肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)[4]為陽性對照藥物,比較正常大鼠PH后72 h PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間肝再生速度、有絲分裂指數(shù)的差別,表明扶正化瘀方具有同HGF類似的促進肝再生的作用。
大鼠70%肝部分切除后10~14 d可完全恢復(fù)缺失肝組織,期間各種細胞迅速有序增殖,剩余的肝細胞大部分在術(shù)后24 h達到DNA合成高峰,少部分肝細胞會出現(xiàn)第二次DNA合成[5]。細胞周期素D1(cyclinD1)是G1期進展的限速控制因素,被認為是細胞進入細胞周期G1期的標志,大鼠肝大部切除術(shù)后24 h肝細胞核 cyclin D1蛋白表達達到高峰[6],馬克學(xué)等[7]研究大鼠肝再生過程中cyclinD1的動態(tài)變化表明PH后72~96 h出現(xiàn)第二次高峰。本研究結(jié)果顯示PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠PH后72 h肝組織cyclin D1 mRNA和肝細胞核cyclin D1蛋白表達均顯著高于單純PH組,而PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間無顯著性差別,表明扶正化瘀方可上調(diào)大鼠PH術(shù)后72 h肝臟cyclin D1的表達。
綜上所述,扶正化瘀方可上調(diào)正常大鼠肝大部切除術(shù)后72 h肝細胞cyclinD1的表達,促進肝再生。為臨床醫(yī)生解決如何促進肝損傷后肝再生和肝功能恢復(fù)提供了新的實驗證據(jù)和治療選擇。
1 秦建民,劉淑琴,曾錦章,等.轉(zhuǎn)化生長因子β1在大鼠肝再生過程中表達變化的實驗研究.中華普通外科雜志,2004,19:180-181.
2 陳國棟,劉玉蘭,尤鵬,等.粒細胞集落刺激因子促進小鼠肝再生的作用.世界華人消化雜志,2006,14:1466-1470.
3 李天興,朱清靜,蔡艷萍,等.大黃對大鼠肝再生過程中cyclinD1影響的實驗研究.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2010,18:227-229.
4 Ogura Y,Hamanoue M,Tanabe G,et al.Hepatocyte Growth Factor Promotes liver regeneration and Protein Synthesis after Hepatectomy in Cirrhotic Rats.Hepato-Gastroenterology,2001,48:545-549.
5 Michalopoulos GK.Liver regeneration.J Cell Physiol,2007,213:286-300.
6 Jaumot M,Estanyol JM,Serratosa J,et al.Activation of cdk4 and cdk2 during rat liver regeneration is associated with intranuclear rearrangements of cyclin-cdk complexes.Hepatology,1999,29:385-395.
7 馬克學(xué),席興宇,李玉昌.大鼠肝再生中CyclinD1、PCNA的動態(tài)變化.河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,33:97-99.