張玉果 趙素賢 李建梅 任偉光 李亞 南月敏

前期動物實驗表明扶正化瘀方可提高大鼠肝大部切除后24 h的肝再生速度。本實驗擬進一步驗證扶正化瘀方對大鼠肝再生的影響，采用大鼠肝大部切除(partial hepatectomy，PH)肝再生模型，以促肝細胞生長素(hepatocyte growth promoting factors，pHGF)為陽性對照藥物，研究扶正化瘀方對大鼠肝大部切除后72 h cyclinD1和肝再生的影響，探討扶正化瘀方促進肝再生的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級雄性Wistar大鼠24只，體重240～280 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部(合格證號:1201030)。扶正化瘀方藥液為由上海黃海制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)的扶正化瘀膠囊用蒸餾水配制成75 g/L。促肝細胞生長素(pHGF)購自長春富春制藥有限公司，批號 H20058141。兔抗人cyclinD1單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。GAPDH、cyclinD1引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司。

GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3';cyclinD1上游引物:5'-GCACAACGCACTTTCTTTCC-3'，cyclinD1下游引物:5'-TCCAGAAGGGCTTCAATCTG-3'。

1.2 動物分組 將雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(對照組)、模型(PH)組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組，每組6只。于實驗前3 d至實驗結(jié)束，扶正化瘀組給予扶正化瘀藥液灌胃1 ml/100 g，pHGF組給予腹腔注射pHGF 1 ml/100 g，對照組、模型組均給予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g，1次/d。

1.3 造模方法 大鼠自由喂養(yǎng)1周后，術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁飲，按照秦建民等［1］介紹的方法在無菌條件下操作，用1%戊巴比妥鈉(用量40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠上腹部做一個縱形長約1 cm的切口，暴露左葉和中葉，在其根部結(jié)扎，切除肝臟左葉和中葉(占70%)，術(shù)畢皮下給予0.9%氯化鈉溶液1 ml，縫合切口，消毒。對照組大鼠僅切開腹腔暴露出肝左葉和中葉，隨后送入腹腔，術(shù)后自由飲食物和水，術(shù)后72 h處死動物，切取全部再生肝組織，稱取濕重。取相同部位肝組織(1.0 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)兩塊，一塊以10%甲醛溶液固定，用于肝組織學(xué)觀察和免疫組化染色，另塊置于5 ml凍存管立即放入－80℃冰箱保存用于肝組織總RNA提取。

1.4 指標檢測

1.4.1 肝臟再生速度:［C －(A －B)/A］×100%，A=B/0.7，即估計全肝重;B=PH時切除的肝葉濕重;C=處死動物時再生肝臟濕重。

1.4.2 肝組織學(xué)檢查:取肝組織經(jīng)10%甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片(厚約4 μm)，經(jīng)蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。有絲分裂指數(shù):每份標本隨機選取400×視野10個，應(yīng)用Image-Pro 5.0圖像分析軟件計算每個視野中有絲分裂肝細胞數(shù)占肝細胞總數(shù)的比例。cyclinD1免疫組化染色并結(jié)合圖像半定量分析計算肝細胞核陽性率。

1.4.3 肝組織cyclinD1 mRNA的表達情況:采用熒光定量RTPCR檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多個樣本均值間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物的一般情況 假手術(shù)組PH術(shù)后1～2 h即可自由飲水、進食，實驗結(jié)束時解剖肝臟如正常肝臟鮮紅色。PH組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組術(shù)后1～2 h清醒，活動力差，需協(xié)助飲水，4～6 h后可自由飲水、進食。4組手術(shù)及術(shù)后死亡率均為0。

2.2 肝臟再生速度 與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝再生速度顯著升高(P＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表14組PH后72 h肝再生速度n=6，%，±s

表14組PH后72 h肝再生速度n=6，%，±s

注:與PH組比較，*P ＜0.05

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2.3 肝組織學(xué)觀察

2.3.1 一般形態(tài)學(xué)觀察:正常肝小葉肝細胞板排列有序，多為單排，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞大小較一致，少數(shù)雙核肝細胞，很少見核分裂(圖1)。PH后72 h肝細胞板部分呈雙排，肝細胞明顯增大，肝細胞及核大小不一，小葉中間帶可見多數(shù)雙核肝細胞及有絲分裂，間質(zhì)細胞反應(yīng)活躍(圖2)。

圖1 正常肝小葉肝細胞板多為單排，以中央靜脈為中心呈放射狀，很少見核分裂(HE×40)

圖2 PH后72 h肝細胞板部分呈雙排，可見多數(shù)雙核肝細胞(細箭頭)及有絲分裂(粗箭頭)，間質(zhì)細胞反應(yīng)活躍(HE×40)

2.3.2 有絲分裂指數(shù):假手術(shù)組很少見到有絲分裂，與假手術(shù)組比較，PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組PH術(shù)后3 d有絲分裂指數(shù)顯著升高(P＜0.05)，與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組有絲分裂指數(shù)顯著升高(P均＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 PH術(shù)后72 h 4組有絲分裂指數(shù)n=6，%，±s

表2 PH術(shù)后72 h 4組有絲分裂指數(shù)n=6，%，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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2.3.3 cyclinD1免疫組化染色:與假手術(shù)組比較，PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P＜0.05);與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P均＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 PH術(shù)后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6，%，±s

表3 PH術(shù)后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6，%，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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2.4 肝組織cyclinD1 mRNA的表達 與假手術(shù)組比較，PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均＜0.05);與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均＜0.05)，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4 PH術(shù)后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6，±s

表4 PH術(shù)后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6，±s

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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3 討論

肝臟再生是一個包括多種細胞增殖，是由多條通路、多種因素共同參與的一種復(fù)雜而又精確的生理過程，最終達到肝組織結(jié)構(gòu)的重建及肝功能恢復(fù)。近期研究認為一些因素包括因子、藥物等可影響肝臟再生［2，3］。扶正化瘀方由丹參、蟲草菌絲、桃仁、五味子、松花粉和絞股藍等六味中藥組成，既往研究多注重于其抗纖維化作用，對肝再生的影響尚無實驗依據(jù)。本研究以肝再生增殖階段重要的細胞因子肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)［4］為陽性對照藥物，比較正常大鼠PH后72 h PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間肝再生速度、有絲分裂指數(shù)的差別，表明扶正化瘀方具有同HGF類似的促進肝再生的作用。

大鼠70%肝部分切除后10～14 d可完全恢復(fù)缺失肝組織，期間各種細胞迅速有序增殖，剩余的肝細胞大部分在術(shù)后24 h達到DNA合成高峰，少部分肝細胞會出現(xiàn)第二次DNA合成［5］。細胞周期素D1(cyclinD1)是G1期進展的限速控制因素，被認為是細胞進入細胞周期G1期的標志，大鼠肝大部切除術(shù)后24 h肝細胞核 cyclin D1蛋白表達達到高峰［6］，馬克學(xué)等［7］研究大鼠肝再生過程中cyclinD1的動態(tài)變化表明PH后72～96 h出現(xiàn)第二次高峰。本研究結(jié)果顯示PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠PH后72 h肝組織cyclin D1 mRNA和肝細胞核cyclin D1蛋白表達均顯著高于單純PH組，而PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間無顯著性差別，表明扶正化瘀方可上調(diào)大鼠PH術(shù)后72 h肝臟cyclin D1的表達。

綜上所述，扶正化瘀方可上調(diào)正常大鼠肝大部切除術(shù)后72 h肝細胞cyclinD1的表達，促進肝再生。為臨床醫(yī)生解決如何促進肝損傷后肝再生和肝功能恢復(fù)提供了新的實驗證據(jù)和治療選擇。

1 秦建民，劉淑琴，曾錦章，等.轉(zhuǎn)化生長因子β1在大鼠肝再生過程中表達變化的實驗研究.中華普通外科雜志，2004，19:180-181.

2 陳國棟，劉玉蘭，尤鵬，等.粒細胞集落刺激因子促進小鼠肝再生的作用.世界華人消化雜志，2006，14:1466-1470.

3 李天興，朱清靜，蔡艷萍，等.大黃對大鼠肝再生過程中cyclinD1影響的實驗研究.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2010，18:227-229.

4 Ogura Y，Hamanoue M，Tanabe G，et al.Hepatocyte Growth Factor Promotes liver regeneration and Protein Synthesis after Hepatectomy in Cirrhotic Rats.Hepato-Gastroenterology，2001，48:545-549.

5 Michalopoulos GK.Liver regeneration.J Cell Physiol，2007，213:286-300.

6 Jaumot M，Estanyol JM，Serratosa J，et al.Activation of cdk4 and cdk2 during rat liver regeneration is associated with intranuclear rearrangements of cyclin-cdk complexes.Hepatology，1999，29:385-395.

7 馬克學(xué)，席興宇，李玉昌.大鼠肝再生中CyclinD1、PCNA的動態(tài)變化.河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，33:97-99.