唐 量，劉晨濤，王園麗，羅 凱，王旭丹

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院運動分子生物學(xué)實驗室，西安710062）

肌肉萎縮一直是人們普遍關(guān)注和重視的問題，近年來在肌肉萎縮等相關(guān)疾病研究方面Myostatin作為新的靶分子倍受關(guān)注［1］。Myostatin基因敲除后出現(xiàn)“雙肌”癥狀被認(rèn)為是骨骼肌生長發(fā)育中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子［2］。本課題組近年來報道了 Myostatin重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化［3］及重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量的影響［4］。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，擬利用基因工程技術(shù)構(gòu)建與 Th細(xì)胞表位TT830-844序列融合的人重組 Myostatin基因疫苗真核表達(dá)載體pVAC-TT-Ms，為重組Myostatin基因疫苗改善肌肉萎縮等病癥的后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 基因疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)檢測

1．1．1 實驗材料 真核表達(dá)載體 pVAC1-cms及抗生素 Zeocin為 Invivogen公司產(chǎn)品；pQE30質(zhì)粒和LipofectinTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；核酸片段純化試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶均為 TaKaRa公司產(chǎn)品；兔抗人Myostatin多克隆抗體為 Bethyl公司產(chǎn)品，熒光標(biāo)記羊抗兔二抗購自華美生物工程公司。

1．1．2 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的構(gòu)建 TT表位序列（Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu）來源于破傷風(fēng)毒素，具有激活Th細(xì)胞的作用。根據(jù)Genebank報道的人Myostatin cDNA序列（No．014793）C-端 330 bp基因片段，合成融合 TT表位的TT-Ms基因序列并克隆至pQE30原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒為pQE-TT-Ms，由上海生物技術(shù)工程公司完成基因片段的合成。

為構(gòu)建融合TT表位的Myostatin基因真核表達(dá)載體，利用PCR技術(shù)在TT-Ms基因序列5′端和3′端的添加 BamH I和 EcoR I酶切位點。上游引物：5′-CGGGA TC CATT TTG GTC TTG ACT GTG-3′，下游引物：5′-GC GAA TTC TGA GCA CCC ACA GCG-3′，引物由上海生物技術(shù)工程公司合成。

PCR擴(kuò)增體系：總體積為50μl，其中1μl pQETT-Ms模板質(zhì)粒，5μl的10×PCR緩沖液，5μl MgCl2（25 mmol／L），1μl 4×dNTPs（25 mmol／L），上游和下游引物各 1μl（25μmol／L），1μl Taq DNA聚合酶，用水補(bǔ)足體積至50μl。PCR擴(kuò)增（PCR儀，美國 Bio-Rad）：95℃預(yù)變性 2 min后，94℃變性 1min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)共30次，最后72℃再延伸10 min。

1．1．3 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的鑒定和純化 用BamH I和EcoR I雙酶切pVAC1-cms質(zhì)粒，回收酶切基因片段。PCR產(chǎn)物用1．2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的片段。將目的基因片段 TT-Ms克隆至真核表達(dá)載體pVAC1-cms，得到重組質(zhì)粒 pVAC-TTMs。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 DH5α，將陽性克隆轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約8 h后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列分析。將測序正確的質(zhì)粒在含Zeocin抗生素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，采用聚乙二醇沉淀法對重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms進(jìn)行純化。

1．1．4 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及目的蛋白的表達(dá)檢測 利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對目的蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測。具體方法為：將CHO細(xì)胞用含100 ml／L胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2條件下培養(yǎng)。以一定密度分別接種于含蓋玻片的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，使80%以上的細(xì)胞貼壁。吸出培養(yǎng)液，在無菌管中各加入2μg純化的pVAC-TT-Ms質(zhì)粒和pVAC1-cms質(zhì)粒，再分別加入100μl無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基；在另兩只無菌管中各加入10μl LipofectinTM2000和90μl無血清和抗生素的培養(yǎng)基，室溫放置10 min；分別與前兩管溶液混合，輕輕混勻，室溫放置15 min。分別向脂質(zhì)體和質(zhì)粒溶液中加入800μl無血清無抗生素的DMEM，輕輕混勻，移入洗過的CHO細(xì)胞中，孵箱中培養(yǎng)7 h，換加1 ml含200 ml／L小牛血清無抗生素的DMEM，在轉(zhuǎn)染36 h后收獲細(xì)胞。取出蓋玻片，用預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞10 min，在蓋玻片滴加10%小牛血清，室溫封閉30 min，吸掉。滴加兔抗人Myostatin多克隆抗體后4℃冰箱放置過夜。滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育60 min。甘油封片后立即于熒光顯微鏡（E1000，日本Nikon公司）下觀察并照相。

1．2 動物免疫及抓力測試

由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供雄性BALB／c小鼠，體重 12～14 g，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后將動物分為三組：正常對照組、空質(zhì)粒對照組和基因疫苗組（n＝8）?；蛞呙缃M和空質(zhì)粒對照組小鼠以純化的質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms和 pVAC1-cms作為抗原，每只按100μg股四頭肌內(nèi)注射，每隔14 d免疫一次動物，共免疫4次。正常對照組在相同時間和部位注射相同劑量的PBS。第四次免疫20 d后進(jìn)行抓力測試，方法參考并改進(jìn) Peled-Kamar等報道的動物前肢抓力測試方法。主要步驟為在離地高80 cm處綁緊一根直徑2 mm的繩子，讓小鼠前肢握住繩子，并固定尾部，記錄小鼠掉落前持續(xù)握住繩子的時間，即完成一次抓力測試。每只小鼠抓力測試重復(fù)3次，重復(fù)間隔時間保持一致。

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

所測數(shù)據(jù)用 SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行組間均值非成對 t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約400 bp處有一條與預(yù)期大小相符的條帶（圖1）。TT-Ms基因片段經(jīng) EcoR I和 BamH I雙酶切，與同樣雙酶切的pVAC1-cms質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAC-TT-Ms。經(jīng) EcoR I和 BamH I酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)在約400 bp處有一條帶（圖2），與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms經(jīng)DNA測序，結(jié)果完全正確（圖 3）。

Fig．1 PCR production of MyostaitnLane 1：DNA marker；Lane 2：PCR production

Fig．2 Restriction analysis of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms Lane 1：DNA marker；Lane 2：Restriction production

Fig．3 Sequencing result of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．2 重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms的純化

質(zhì)粒純化結(jié)果顯示，pVAC1-cms質(zhì)粒含量為1．25μg／μl，pVAC-TT-Ms質(zhì)粒含量為 1．32μg／μl；pVAC1-cms質(zhì)粒和pVAC-TT-Ms質(zhì)粒OD260／OD 280比值分別為1．78和1．82，證明質(zhì)粒不含蛋白質(zhì)等雜物；電泳結(jié)果顯示純化質(zhì)粒超螺旋、螺旋和線形條帶明晰（圖4）。以上結(jié)果證明純化質(zhì)粒符合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)量要求。

Fig．4 Purification of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．3 細(xì)胞免疫熒光檢測真核細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測純化質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染36 h后的CHO細(xì)胞。結(jié)果顯示，重組pVAC-TT-Ms質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞明顯著色，而空質(zhì)粒pVAC1-cms轉(zhuǎn)染的 CHO對照細(xì)胞無熒光著色（圖5），證明重組pVAC-TT-Ms質(zhì)粒體外可以在真核細(xì)胞CHO中表達(dá)目的蛋白。

Fig．5 Detecting the transferring CHOcells with cell immunofluorescence technique（×200）A：CHOcell transfected with pVAC1-cms plasmids；B：CHO cell transfected with pVAC-TT-Ms plasmids；CHO：Chinese hamster ovary

2．4 重組Myostatin基因疫苗對免疫小鼠抓力的影響

小鼠抓力測試結(jié)果顯示，對照組小鼠前肢抓力平均時間為（33．50±2．72）s，融合 TT表位的重組Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的小鼠前肢抓力平均時間為（47．78±3．51）s，與對照組比較提高顯著，免疫小鼠前肢抓力平均增加了29．88%（圖6A）。為了排除體重對抓力的影響，進(jìn)一步分析免疫小鼠抓力與體重的比值，結(jié)果與正常對照組小鼠比較，基因疫苗免疫小鼠平均增加了24．31%，增加顯著（圖 6B）。

3 討論

廢用性肌肉萎縮一直是人們普遍關(guān)注和重視的問題，許多學(xué)者對廢用性肌萎縮的治療進(jìn)行了深入研究，但仍無突破性進(jìn)展。Myostatin作為骨骼肌生長發(fā)育的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，在廢用性肌肉萎縮方面的研究倍受關(guān)注。

本實驗選用人重組 Myostatin基因疫苗免疫誘導(dǎo)特異性抗體進(jìn)而抑制其體內(nèi)活性，而構(gòu)建人重組Myostatin基因疫苗的關(guān)鍵是打破免疫耐受。Th細(xì)胞表位TT序列，有利于自身的免疫系統(tǒng)所識別，誘發(fā)免疫反應(yīng)。本實驗在構(gòu)建 Myostatin基因疫苗時N-端融合了Th細(xì)胞表位TT序列，以打破Myostatin免疫時耐受，增強(qiáng)Myostatin基因疫苗的免疫效果。

Fig．6 Grip test in immunized miceA：Relationship of grip time（x-axis）to body weight（y-axis）for each animal；B：Average value of the grip time／body weight．The average value of the time／body weight of the mice immunized with pVAC-TT-Ms was about 24．31%greater than that of control mice*P＜0．05 vs control

質(zhì)粒pVAC1-cms是一種高效和安全的基因疫苗專用質(zhì)粒。將Myostatin成熟肽基因片段克隆至pVAC1-cms質(zhì)粒IL-2的信號肽序列和胎盤堿性磷酸酶（PLAP）的跨膜錨定位點序列之間，確保表達(dá)的抗原蛋白被錨定在細(xì)胞的表面，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms由脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，使外源目的蛋白整合穩(wěn)定，并高效擴(kuò)增和表達(dá)目的蛋白。

本實驗將多種優(yōu)勢結(jié)合，首次構(gòu)建融合 Th細(xì)胞表位序列人重組 Myostatin基因疫苗真核表達(dá)載體pVAC-TT-Ms，瞬時轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞并免疫熒光技術(shù)檢測，目的蛋白在轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞中明顯表達(dá)。測定OD260和OD280比值和電泳分析表明，重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms質(zhì)量符合免疫動物時基因疫苗的要求。重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms免疫小鼠可顯著提高免疫小鼠前肢的抓力。

Whittemore等［5］報道動物體內(nèi)注射 Myostatin的特異性抗體，可抑制 Myostatin的活性，進(jìn)而提高動物骨骼肌質(zhì)量和力量。雖然 Myostatin抗體在治療肌肉相關(guān)疾病的過程中效果良好，由于純化困難、造價昂貴等不便限制了抗體的廣泛應(yīng)用，因此，研發(fā)針對該蛋白主動免疫的疫苗有更好的應(yīng)用前景。下一步課題組計劃比較 Myostatin基因疫苗的量效和時效關(guān)系，分析該疫苗提高免疫動物骨骼肌質(zhì)量和力量的分子機(jī)制，為重組 Myostatin基因疫苗治療廢用性肌肉萎縮等病癥方面的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

［1］ Elkina Y，von Haehling S，Anker SD，et al．The role of myostatin in muscle wasting：an overview［J］．J Cachexia Sarcopenia Muscle，2011，2（3）：143-151．

［2］ McPherron A C，Lawler A M，Lee SJ．Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member［J］．Nature，1997，387（6628）：83-90．

［3］ 唐 量，王園麗，張萬金，等．Myostatin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)、純化與鑒定［J］．陜西師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，38（6）：77-81．

［4］ 唐 量，張萬金，王園麗，等．Myostatin重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量的影響［J］．中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2011，30（2）：149-153．

［5］ Whittemore L A，Song K，Li X，et al．Inbibition of myostatin in adult mice increnses skeletal muscle mass and strength［J］．Biochem Biophys Res Commun，2003，300（4）：965-971．