劉愛旗　夏璐

【摘要】 目的：探討CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細(xì)胞活性的最佳實(shí)驗(yàn)條件，并比較其優(yōu)略。方法：以傳至第3代的兔成纖維細(xì)胞為研究對象，分別用CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果：MTT法的最佳檢測波長490 nm，CCK-8法最佳檢測波長為450 nm，兩法的最佳檢測時(shí)間均為加入試劑后4 h。適宜檢測的細(xì)胞數(shù)量范圍為2×103/ml ～1×105 /ml 個(gè)。結(jié)論：CCK-8法較MTT法檢測的靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種優(yōu)于MTT法的檢測兔成纖維細(xì)胞增殖活性的方法。

【關(guān)鍵詞】 CCK-8； MTT； 兔成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

檢測細(xì)胞增殖活性的方法很多，如3H放射性同位素?fù)饺敕?、?xì)胞儀法、臺盼藍(lán)染色法、MTT法等。其中以MTT法以其快速而簡便、不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用，但MTT法形成的Formazan為水不溶性的[1]，加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清液時(shí)可能會丟失小部分的Formazan，故有時(shí)重復(fù)性略差。為了避免Formazan的部分丟失，研究人員又開發(fā)了很多水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等[2]，本文對CCK-8法和MTT法檢測兔成纖維細(xì)胞增殖活性的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探討，并比較其優(yōu)略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 以兔筋膜作為成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)組織，培養(yǎng)、傳代并培養(yǎng)傳至第3代，以第3代的成纖維細(xì)胞為研究對象[3]。

1.2 材料與儀器 胎牛血清、胰酶、DMEM、雙抗、PBS液。60 mm培養(yǎng)皿、倒置相差顯微鏡、離心機(jī)、96孔板、酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 最佳檢測波長和最佳測定時(shí)間 取以對數(shù)生長期的第3代兔成纖維細(xì)胞，以0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù)、接種于接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液，濃度為1×104個(gè)/ml，重復(fù)種植5個(gè)孔，在空白對照孔加入培養(yǎng)基100 μl，在96孔板的四周加PBS液100 μl，以保持96孔板的濕度。連續(xù)接種6個(gè)96孔板，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。CCK-8組每孔加入10 μl CCK-8試劑，在37 ℃恒溫箱中分別繼續(xù)孵育1、2、3、4、5、6 h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組的OD值，檢測5個(gè)孔的OD值，并取其平均值；檢測MTT組時(shí)吸去上清液，并在每孔加入100 μl含MTT試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h，檢測前先吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl的DMSO液，振蕩使其溶解，分別檢測其不同波長下的OD值[4]。

1.3.2 細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系 取對數(shù)期生長第3代兔成纖維細(xì)胞，以0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù)、接種于接種于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)孔細(xì)胞濃度從高到低依次為4×104個(gè)/ml、

2×104個(gè)/ml、1×104個(gè)/ml、5×103個(gè)/ml、2.5×103個(gè)/ml、1.25×103個(gè)/ml、7.5×102個(gè)/ml、4×102個(gè)/ml、2×102個(gè)/ml，每個(gè)濃度種5孔，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，分別加入CCK-8試劑和MTT試劑，在酶標(biāo)儀上測量其OD值。

2 結(jié)果

2.1 最佳檢測波長的確定 如圖1所示，用CCK-8法檢測兔成纖維細(xì)胞活性時(shí)，在450 nm處的吸光峰值最高，CCK-8法檢測時(shí)的最佳波長為450 nm。由圖2可知，MTT法檢測時(shí)的最佳波長為490 nm。

2.2 最佳測定時(shí)間的確定 從圖1、圖2可見，在加入MTT試劑和CCK-8試劑后，孵育1～6 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀分別檢測1～6 h的OD值，孵育1～4 h，OD值呈上升趨勢，4～6 h OD值出現(xiàn)下降的趨勢，孵育4 h時(shí)檢測OD值最大，靈敏度最高。因此用MTT法和CCK-8法檢測兔筋膜成纖維細(xì)胞的活性時(shí)，應(yīng)該在加入MTT試劑和CCK-8試劑孵育后的4 h檢測最佳[5]。

2.3 細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系 用兩種方法檢測細(xì)胞數(shù)量與吸光度的關(guān)系如圖3所示。從圖3可見，隨著細(xì)胞濃度的增加，兩種方法測得的OD值都增大，在103處OD值開始增加較明顯，104處OD值接近峰值，隨著濃度增加，OD值增加的不明顯。

3 討論

MTT法的優(yōu)點(diǎn)：簡單、方便、快速、無放射性污染、應(yīng)用范圍廣。缺點(diǎn)：MTT法的中間代謝產(chǎn)物為不溶于水的結(jié)晶物，在加入有機(jī)溶劑前需要棄上清液，會造成一定的誤差。而CCK-8法的中間代謝產(chǎn)物為可溶性的，且不需要棄上清液，操作相對較為簡便[6]。

從圖3可以看出，CCK-8法測得的OD值始終大于MTT法測得的OD值，另CCK-8法比MTT法對細(xì)胞濃度變化更敏感，測得的結(jié)果更為準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)還探討了MTT法和CCK-8法在測定兔成纖維細(xì)胞的最佳實(shí)驗(yàn)條件，MTT法的最佳檢測波長490 nm，CCK-8法最佳檢測波長為450 nm，兩法的最佳檢測時(shí)間均為加入試劑后4 h。適宜的細(xì)胞數(shù)量范圍2×103～1×105個(gè)。

綜上所述，CCK-8法較MTT法檢測的靈敏度高，準(zhǔn)確性好，是一種優(yōu)于MTT法的檢測兔成纖維細(xì)胞增殖活性的方法。

參考文獻(xiàn)

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[5] 熊建文，肖化，張鎮(zhèn)西.MTT法和CCK-8法檢測細(xì)胞活性之測試條件比較[J].激光生物學(xué)報(bào)，2007，10（5）：559-560.

[6] 辛陪成，楊圣.CCK-8法檢測兔筋膜成纖維細(xì)胞增殖活性之最佳測試條件研究[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（4）：6-8.

（收稿日期：2012-11-23） （本文編輯：陳丹云）