強(qiáng)者

（遼寧省昌圖縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心，遼寧　昌圖112599）

LDL對(duì)小鼠精原干細(xì)胞冷凍復(fù)蘇的影響試驗(yàn)

強(qiáng)者

（遼寧省昌圖縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心，遼寧昌圖112599）

本試驗(yàn)以7d雄性昆系小白鼠為試驗(yàn)材料，采用非滲透性冷凍保護(hù)劑低密度脂蛋白（LDL），以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL四種不同的濃度梯度添加到基礎(chǔ)液中，分別在冷凍后1d、3d、和7d時(shí)檢測小鼠精原干細(xì)胞的凍后復(fù)蘇率。結(jié)果表明，-80℃超低溫冰箱冷凍保存小鼠精原干細(xì)胞時(shí)，冷凍1d時(shí)，基礎(chǔ)液中添加2mg/mL的LDL精原干細(xì)胞的復(fù)蘇效果最高，達(dá)到86.39%，與基礎(chǔ)液中添加1mg/mL的LDL組差異不顯著，但顯著優(yōu)于其他組（P＜0.05）。當(dāng)冷凍7d時(shí)，基礎(chǔ)液中添加2mg/mLLDL時(shí)精原干細(xì)胞的復(fù)蘇率顯著高于其他組（P＜0.05）。

精原干細(xì)胞；冷凍保存；復(fù)蘇率；低密度脂蛋白（LDL）

精原干細(xì)胞（SSCs）指位于曲精細(xì)管基膜上既能自我更新維持自身適量恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞的一類原始精原細(xì)胞。精原干細(xì)胞的冷凍保存為雄性生殖細(xì)胞以及遺傳資源的保存提供了一種新的途徑。低密度脂蛋白（LDL）屬于非滲透性保護(hù)劑，一方面具有冷凍保護(hù)作用，另一方面還可以提供能量。本試驗(yàn)采用非滲透性保護(hù)劑低密度脂蛋白作為精原干細(xì)胞的抗凍劑，以檢測其對(duì)精原干細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇效果，以期為精原干細(xì)胞的長期保存奠定基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選擇30～35只7～8日齡雄性昆明小鼠（由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2冷凍保護(hù)劑用法本試驗(yàn)采用非滲透性保護(hù)劑低密度脂蛋白（LDL）作為精原干細(xì)胞的抗凍劑，以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的不同濃度梯度，對(duì)小鼠精原干細(xì)胞的冷凍后復(fù)蘇率進(jìn)行測定研究。對(duì)照組中不加任何冷凍保護(hù)劑。統(tǒng)計(jì)冷凍保存后第1d、3d和7d時(shí)精原干細(xì)胞冷凍后的復(fù)蘇率。

1.3精原干細(xì)胞的冷凍方法本試驗(yàn)采用-80℃的超低溫冰箱冷凍保存小鼠精原干細(xì)胞。

（1）處死7日齡的雄性昆系幼鼠，無菌迅速取出睪丸；

（2）除去脂肪膜并用PBS清洗2～3次，加入10倍體積0.25%胰蛋白酶和DNaseⅠ酶在34℃溫度下消化10～15min，離心棄上清；

（3）加入等體積的膠原酶消化6～10min，DMEM/10% FBS終止消化，然后800r/min離心3min，并洗滌細(xì)胞2次；

（4）0.1%臺(tái)盼藍(lán)染色3～5min，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；

（5）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，待小鼠精原干細(xì)胞純度大于75%時(shí)，將其加入到無凍存液和有凍存液的1.5mL冷凍管中，平衡后放入-80℃超低溫冰箱；

（6）-80℃超低溫冰箱中取出冷凍管，37℃水浴快速溶解后離心（800r/min，3min），并洗滌2次；

（7）0.1%臺(tái)盼藍(lán)染色3～5min，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并在倒置顯微鏡下隨機(jī)取數(shù)個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)死、活細(xì)胞數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)拒染者為活細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色者為死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇率。

2　統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。選取冷凍1、3和7d時(shí)的精原干細(xì)胞分別觀察冷凍效果，所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件（SPSS，Chicago，IL，U.S.A）分析。

3　結(jié)果與分析

本試驗(yàn)采用非滲透性冷凍保護(hù)劑低密度脂蛋白（LDL），以1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL的不同濃度梯度，對(duì)小鼠精原干細(xì)胞的冷凍后復(fù)蘇率進(jìn)行測定研究。對(duì)照組中不加任何抗凍劑。統(tǒng)計(jì)冷凍保存第1d、3d和7d冷凍時(shí)間條件下，精原干細(xì)胞冷凍后的復(fù)蘇率在所有的冷凍組中的測定結(jié)果見表1，圖1。

表1　不同濃度梯度低密度脂蛋白（LDL）對(duì)精原干細(xì)胞凍后復(fù)蘇率的影響（N=3，%）

由表1和圖1可知，在凍存1d后，1mg/mL和2mg/mL低密度脂蛋白（LDL）細(xì)胞的復(fù)蘇率均高于85%，而對(duì)照組的復(fù)蘇率只有50%，差異顯著。在冷凍第7d時(shí)，只有2mg/mL的低密度脂蛋白（LDL）細(xì)胞的復(fù)蘇率高于70%，其余濃度的大幅度下降。

4　結(jié)論

在基礎(chǔ)液中添加2mg/mL的低密度脂蛋白（LDL），于-80℃超低溫冰箱冷凍保存時(shí)，小鼠精原干細(xì)胞的復(fù)蘇效果最佳。

圖1　不同濃度梯度低密度脂蛋白（LDL）對(duì)精原干細(xì)胞凍后復(fù)蘇率的影響（N=3）

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.06.015