程亮亮，占松鶴，朱良強

（1.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230000；2.安徽省動物疫病預防與控制中心，安徽合肥230022；3.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以妊娠母豬流產、產死胎、弱胎、木乃伊胎及仔豬發(fā)熱、呼吸困難為主要臨床癥狀的一種病毒性傳染病。由于部分患豬耳部發(fā)紺變藍，故又稱“豬藍耳病”。該病最早于1987年暴發(fā)于美國，隨后很快傳播至歐洲各國。郭寶清等［1］最早從疑似本病的豬群中成功分離到PRRSV，從而證明該病在我國的存在。PRRSV 屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股線狀正鏈RNA 病毒，其基因組RNA 具有高度的變異性和感染性。國際上根據PRRSV 基因組的差異，將其分為歐洲型（以標準株Lelystad virus為代表）和美洲型（以標準株ATCC VR-2332為代表）2種基因型，而在我國流行的PRRSV 主要是美洲型。

近年來，該病已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要動物疫病之一，尤其是2006 年我國南方暴發(fā)的“豬高熱病”，給養(yǎng)豬產業(yè)造成了嚴重的經濟損失，后經國內學者研究證實［2-3］，引起此次疫病暴發(fā)的最主要致病原就是變異的高致病性PRRSV。近來，國內還有報道從家蠅［4］和三帶喙庫蚊［5］體內分離到了PRRSV，這說明除豬以外的其他動物可能會成為PRRSV 攜帶者，從而促進該病在豬群中的傳播。目前對PRRS還沒有有效的治療藥物和方法，因而建立有效的檢測方法是預防和控制該病最為重要的環(huán)節(jié)。但由于豬群感染PRRSV 容易引起免疫抑制，常繼發(fā)其他細菌和病毒感染，并且該病與其他繁殖障礙性疾病的臨床癥狀又極為相似，從而使得臨床診斷確診該病變得十分困難，必須結合病毒分離、血清學試驗及分子生物學技術等進行綜合診斷才能確診。本文就PRRS 診斷技術的發(fā)展概況進行闡述。

1 臨床診斷

豬是PRRSV 的唯一天然宿主，各個日齡和品種的豬均易感，因而出現(xiàn)的臨床癥狀也不盡相同，根據發(fā)病嚴重程度，可將該病分為急性型、慢性型及亞臨床感染。

1.1 急性型

急性型常見于強毒株感染或首次感染的豬群，多呈暴發(fā)流行。豬群發(fā)病初期表現(xiàn)為厭食，精神萎靡，嗜睡，體溫升高（40℃以上），有咳嗽、氣喘等不同程度的呼吸困難癥狀，個別嚴重病豬的耳尖、四肢內側及腹下發(fā)紫，皮下出現(xiàn)一過性血斑。母豬在妊娠前期發(fā)生早產，妊娠后期發(fā)生流產、死胎、弱胎及木乃伊胎。早產、流產后的母豬精神狀況好轉，而后出現(xiàn)重復發(fā)情的現(xiàn)象，卻常常屢配不孕。妊娠期感染的早產仔豬在出生后當時或幾天內死亡，大多數(shù)仔豬有共濟失調、肌肉震顫，甚至后肢麻痹等神經癥狀以及呼吸困難、噴嚏等呼吸道癥狀，有的仔豬耳部發(fā)紫，病死率高達80%以上。種公豬發(fā)病率較低，感染后常出現(xiàn)精液品質下降，射精量少，精液帶毒，性欲減弱等癥狀，需較長的時間才能恢復至感染前水平。荷蘭曾提出了一種簡易的僅適合臨床診斷急性PRRS的方法，即超過20%的死胎率；至少8%的母豬早產或流產；仔豬出生后第1 周死亡超過25%。這3項標準中有兩項符合即可初步診斷為PRRS，但是應特別注意與諸如豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒及日本腦炎病毒感染等其他具有相似癥狀的疾病相區(qū)別。

1.2 慢性型

慢性型多由急性型轉變而來，常見于PRRS流行結束后數(shù)月或數(shù)年內，其病程較長，病情較急性型相對緩和，病毒在豬體內長期存在，造成持續(xù)性感染，主要影響豬群的生產性能，引起仔豬、育肥豬生長率降低以及母豬繁殖率不高。同時，由于PRRSV 感染會引起免疫抑制，導致豬體免疫力下降，易繼發(fā)感染其他細菌和病毒，特別是呼吸道病原體的感染，從而增加呼吸道疾病的發(fā)生，這是目前PRRS危害養(yǎng)豬業(yè)的最主要形式。

1.3 亞臨床型

亞臨床型主要表現(xiàn)為感染豬不發(fā)病，但血清PRRSV 抗體陽性。有血清學調查表明［6］，有些豬場沒有出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但是豬群血清陽性率卻達到50%以上。目前對PRRSV 亞臨床感染的認知還不是很深入。

2 病毒分離

多種臨床樣品可用于PRRSV 的分離，包括病豬的腦、肺、脾、肝、心、淋巴結、扁桃體、十二指腸、鼻拭子、糞便及血清、血漿等。有研究表明［7］，PRRSV對肺臟的親嗜性最高，其病毒含量明顯高于其他感染器官組織，因而肺臟是最理想的病毒分離材料。相對于成年豬，弱胎、活仔豬更適合病毒分離，而從木乃伊胎中則不能分離出病毒。由于PRRSV 在組織中容易失活，在采取組織樣品后應立即冷凍保存，并及時送至實驗室，這樣才能保證病毒的成功分離。目前用于PRRSV 分離的細胞主要有豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophages，PAM）、非洲綠猴腎上皮細胞 MA104 及其克隆株 Marc-145、CL2621等細胞系。其中，PAM 對PRRSV 的敏感性最高，是分離診斷PRRSV 的經典細胞系，不過也有其自身的不足，包括耗費大、難獲取及易污染其他病原體等缺點。Marc-145 細胞對PRRSV 也具有較好的敏感性，是目前分離PRRSV 較為常用的細胞系，但該細胞系對實驗技術性要求比較高，病毒分離難度較大。另外，由于不同的PRRSV 株在上述細胞培養(yǎng)物上生長繁殖引起細胞病變的情況各不相同，因此，在進行病毒分離時最好結合如RT-PCR、IFA 等其他抗原檢測方法進行鑒定，從而使結果更加可靠。雖然病毒分離是檢測PRRS 最為確切的方法，但由于其具有耗時長、勞動力需求大、技術性要求高、操作繁瑣及容易發(fā)生污染等缺點，而不能在實際生產及臨床檢測中得到普遍推廣和應用。

3 血清學試驗

目前，用于PRRS診斷的血清學試驗主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescent assay，IFA）、免疫過氧化物酶單層細胞試 驗（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）、血清病毒中和試驗（serum virus neutralization test，SVNT）及乳膠凝集試驗（latex agglutination test，LAT）等方法。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

PRRSV 具有6種結構蛋白（GP2，GP3，GP4，GP5，M 及N 蛋白），其中N 蛋白和GP5蛋白是主要的免疫原性蛋白。目前，國內外建立起來的關于PRRSV 的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，大部分都是以N 蛋白和GP5 蛋白為檢測抗原，從而對PRRSV 抗體進行檢測。Chu J Q 等［8］就以重組N蛋白為抗原，建立了一種檢測PRRSV 抗體的間接ELISA 方法，該方法敏感性和特異性好，比IDEXX ELISA具有更高的精確性。不久 前，Chen Y 等［9］利用重組GP5 蛋白抗原建立了一種檢測PRRSV抗體的間接ELISA 方法，該方法能特異、敏感的檢測出PRRSV 抗體，并將其與LSI PRRSV-Ab檢測試劑盒進行比較，其陽性樣品檢出率要高于后者。由于ELISA 良好的特異性和敏感性，它比IPMA更適合用于血清早期PRRSV 抗體的檢測。同時，ELISA 具有快速、經濟、操作過程和檢測結果能夠半自動化和標準化等優(yōu)點，因而特別適合于大規(guī)模臨床樣品檢測。目前，ELISA 已成為檢測PRRSV血清抗體最為廣泛使用的血清學方法。

3.2 間接免疫熒光試驗

間接免疫熒光試驗（IFA）主要用于檢測血清中的PRRSV 抗體，目前廣泛應用于北美國家。其敏感性和特異性與IPMA 相當，該試驗是在PAM、CL2621及MARC-145 等細胞培養(yǎng)物上進行的。Sagong M 等［10］在對BHK細胞系穩(wěn) 定 表 達PRRSV 病毒粒子中N 蛋白的研究中，使用能穩(wěn)定表達N 蛋白的BHK 細胞系為診斷抗原，與N 蛋白特異性單克隆抗體進行熒光反應，結果顯示BHK細胞系也可以作為IFA 檢測PRRSV 抗體的細胞培養(yǎng)物。IFA 亦可用于檢測PRRSV 抗原，陳仕龍等［11］建立了利用2株針對PRRSV GP5蛋白的單克隆抗體（McAb-A61，McAb-C65）鑒別檢測PRRSV 美洲株、歐洲株及高致病性毒株3 種抗原的間接免疫熒光試驗，該方法能夠準確區(qū)分這3種毒株，與商品化PRRSV RT-PCR鑒別試劑盒檢測結果符合率為100%。IFA 方法特異性強、敏感性高、速度快，但其也有不足，即容易出現(xiàn)非特異性染色，而影響結果判定的客觀性，因此需在試驗過程中盡量避免引起非特異性染色因素的干擾。

3.3 免疫過氧化物酶單層細胞試驗

免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）是最早建立的主要用于檢測PRRSV 抗體的血清學方法，由于其具有較好的敏感性和特異性，至今仍是歐洲國家廣泛使用的常規(guī)血清學檢測方法。IPMA 主要在PAM、CL2621 及Marc-145 等細胞培養(yǎng)物上進行，最早可從感染后1周～2周的豬體內檢測到特異性抗體。譚斌等［12］通過對IPMA 反應條件進行優(yōu)化的基礎上，建立了一種特別適用于美洲型PRRSV 抗體的檢測方法，并組裝成PRRSV-IPMA抗體檢測試劑盒，方法具有較好的敏感性和特異性。然而，IPMA 檢測結果易受個人主觀因素即操作者視覺因素的影響，不能十分準確的判定出弱陽性樣品，因而需對操作人員進行專門的培訓。

3.4 血清病毒中和試驗

血清病毒中和試驗（SVNT）檢測PRRSV 血清抗體具有高度特異性，可以用于對不同PRRSV 毒株的鑒定。但其敏感性較低，遠不如IPMA 和IFA，雖然Yoon等對常規(guī)SVNT 進行了改良，即在病毒稀釋液中加入200 mL／L 的新鮮健康豬血清，但最早也只能檢測到感染后9d～11d的PRRSV抗體，并且該方法技術性要求高，試驗耗時長，工作量大，所以SVNT 一般不用于臨床早期診斷，尤其是急性感染的檢測。SVNT 目前主要應用于實驗室科學研究中。

3.5 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗（LAT）是一種以乳膠顆粒作為載體的間接凝集試驗，即將可溶性抗原吸附于其表面，加入特異性抗體后，可產生凝集反應。王忠等［13］是國內最早將LAT 應用于PRRSV 抗體的檢測，他們利用純化的PRRSV 重組M 蛋白致敏乳膠制成乳膠抗原，成功建立了LAT。應用該方法對76份豬血清樣品進行檢測，并與美國IDEXX 公司ELISA 試劑盒相比較，結果顯示LAT 的敏感性和特異性均為95%，兩者的總符合率為87%，檢出率基本一致。許立華等［14］利用PRRSV 重組N 蛋白初步建立了檢測PRRSV 血清抗體的LAT，對200份臨床血清樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，與IDEXX 公司ELISA 試劑盒及重組N 蛋白-ELISA 符合率分別為78%和93%，這表明該方法試驗特異性較好，但敏感性需進一步調整。雖然LAT 在反應性上有所不足，但作為檢測PRRSV 抗體的一種新方法，且具有快速、簡便、價廉及可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，其研究和應用前景還是十分廣闊的。

4 分子生物學檢測

4.1 RT-PCR

應用病毒分離法檢測PRRSV 繁瑣、費時、工作量大，而血清學方法一般多用于檢測PRRSV 抗體，因此這就需要一種更為有效的PRRSV 檢測方法。反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）目前被認為是檢測PRRSV 最為準確有效的方法。而用于檢測PRRSV 的RT-PCR 方法主要有常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR 及實時熒光定量RT-PCR 等方法。

4.1.1 常規(guī)RT-PCR 應用常規(guī)RT-PCR 能夠特異、敏感地檢測出樣品中的PRRSV，何世成等［15］針對變異PRRSV 的核苷酸缺失區(qū)域設計了一對引物，建立了變異PRRSV 快速RT-PCR檢測體系，該方法具有良好的特異性和敏感性，能夠檢測經10萬稀釋后的臨床陽性樣品。常規(guī)RT-PCR 還可用來鑒別診斷不同型PRRSV 毒株，周丹等［16］通過對PRRSV 普通株和變異株Nsp2 基因序列進行比對分析，設計合成了3 條引物，建立了一步鑒別診斷PRRSV 普通株與變異株的RT-PCR檢測方法，結果通過不同大小的RT-PCR 擴增產物將二者區(qū)分開來，該方法最低能檢測到1.5pg的核酸含量。鑒于常規(guī)RT-PCR 快速、準確和有效的特點，以及良好的特異性和敏感性，該方法現(xiàn)已成為臨床診斷和控制PRRS最為廣泛使用的檢測技術。

4.1.2 套式RT-PCR 套式RT-PCR 使用兩對引物進行DNA 片斷的特異性擴增，較常規(guī)RT-PCR方法，其反應的特異性和敏感性得到了極大地提高。李和平等［17］于2009年建立了檢測PRRSV 的套式RT-PCR，該方法具有極高的敏感性，將106.5TCID50的PRRSV 細胞毒稀釋10 000倍后，依然能擴增出相應的目的片段，并且具有較好的重復性和特異性。Reicks D L等［18］在對接種感染PRRSV 后6d內的公豬精液和血清進行檢測時發(fā)現(xiàn)，采用套式RTPCR 從接種感染24h 后的血清中就能檢測出PRRSV，比從精液中能更早更敏感的檢測出病原。盡管套式RT-PCR 具有反應性上的優(yōu)點，但由于其檢測時間較長，成本較高，并且易發(fā)生交叉污染，因而在實用性上不利于廣泛推廣。

4.1.3 實時熒光定量RT-PCR 實時熒光定量RT-PCR 比常規(guī)RT-PCR 具有更多優(yōu)勢，其特異性和敏感性更高，不易發(fā)生污染，檢測速度快，并且自動化程度高。Tian H 等［19］使用染料SYBR Green I建立了一步檢測PRRSV 的實時熒光定量RT-PCR方法，將病毒RNA（9.6×105拷貝）樣品作10倍系列稀釋，該方法最低能檢測到10-5稀釋的病毒RNA 樣品，而常規(guī)RT-PCR 只能檢測到10-4稀釋。Wernike K 等［20］建立了一種鑒別檢測PRRSV 變異型、美洲型和歐洲型的多重實時熒光定量RT-PCR，該方法敏感性高，能夠從樣品中檢測出少于200拷貝／μL的歐洲型PRRSV 以及20 拷貝／μL 的美洲型和變異型PRRSV。當采集的臨床樣品中病毒RNA 量較少時，應用實時熒光定量RT-PCR 是最佳的選擇，但該方法需要一定的專業(yè)實驗技術及條件，且檢測成本相對較高。目前，實時熒光定量RTPCR 多用于PRRSV RNA 的定量分析和基因分型的研究。

4.2 反轉錄-環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi T 等［21］在2000年開發(fā)出來的一種新型核酸擴增方法，其特點是針對目的基因的6個特定區(qū)域設計4種不同的特異性引物，在63℃左右的恒溫條件下自動循環(huán)置換合成DNA，從而完成核酸擴增反應，這在普通的水浴鍋或者恒溫加熱器中就能進行。而將LAMP 與反轉錄結合起來就可以對RNA 病毒進行檢測了，即反轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）。Zhang L 等［22］基于PRRSV 的nsp2基因設計了6種引物，以此建立了檢測美洲型PRRSV 的RT-LAMP方法，該技術具有較好的特異性，對42份臨床樣品的檢測結果顯示，RT-LAMP 的敏感性要稍高于RT-PCR。Chen C等［23］以PRRSV 的M 基因為模板，設計了3對引物，成功建立了用于快速檢測PRRSV 的RTLAMP方法，其敏感性是RT-PCR 的100倍，并可與熒光定量RT-PCR 相媲美。由于RT-LAMP 操作簡單，不依賴特殊的儀器設備，快速，較高的特異性及靈敏度，而使其在疾病的診斷和監(jiān)測等方面逐漸得到了廣泛應用。然而RT-LAMP 也有一點不足，即容易出現(xiàn)假陽性，盡管如此，RT-LAMP 自身所具備的優(yōu)點還是使其具有十分廣闊的應用前景。

5 小結

PRRS給當前世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，嚴重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，采用高效、準確的檢測技術對PRRS進行診斷和控制是至關重要的。而用于PRRS檢測的技術有多種，每種檢測方法均有其自身的優(yōu)點與不足，我們應根據實際檢測需要及實驗條件等情況來綜合選擇合適的檢測技術，從而為該病的診斷和防控措施的制訂提供有力的依據。今后，隨著人們對PRRSV 各方面研究的不斷深入，我們相信更好的檢測技術將會不斷出現(xiàn)。

［1］郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS 流產胎兒分離PRRSV 的研究［J］.中國畜禽傳染病，1996（2）：1-4.

［2］Tian K，Yu X，Zhao T，et al.Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark［J］.PLoS One，2007，2（6）：e526.

［3］童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2007（5）：323-326.

［4］路憲禮，王開功，文明，等.家蠅體內豬繁殖與呼吸綜合征病毒的初步分離與鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012（2）：24-27.

［5］史開志，毛君婷，王開功，等.三帶喙庫蚊攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的初步證實［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2009（2）：280-284.

［6］楊小燕，李曉華，沈紹新，等.豬繁殖與呼吸綜合征的血清學調查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2001（4）：17-18.

［7］榮福龍，劉永剛，孫廣力，等.應用熒光定量RT-PCR方法檢測PRRSV 變異株在仔豬體內動態(tài)分布［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2010（9）：681-686.

［8］Chu J Q，Hu X M，Kim M C，et al.Development and validation of a recombinant nucleocapsid protein-based ELISA for detection of the antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Microbiol，2009，47（5）：582-588.

［9］Chen Y，Tian H，He J H，et al.Indirect ELISA with recombinant GP5for detecting antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Virol Sin，2011，26（1）：61-66.

［10］Sagong M，Park C K，Kim S H，et al.Development and characterization of stable cell lines constitutively expressing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein［J］.J Vet Sci，2010，11（2）：169-171.

［11］陳仕龍，黃梅清，林天龍，等.高致病性豬生殖與呼吸綜合征病毒間接免疫熒光鑒別方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2009（1）：41-44.

［12］譚 斌，劉長明，危艷武，等.PRRSV-IPMA 抗體檢測試劑盒的研制及其應用［J］.中國獸醫(yī)科學，2006（11）：880-884.

［13］王 忠，楊漢春，郭 鑫，等.重組M 蛋白-乳膠凝集試驗檢測PRRS病毒血清抗體的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2002（7）：11-13.

［14］許立華，蘇鑫銘，劉華雷，等.檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的重組N 蛋白-乳膠凝集試驗的建立［J］.中國病毒學，2004（4）：401-403.

［15］何世成，鄒 敏，劉道新，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（7）：10-13.

［16］周 丹，郭萬柱，漆信橋，等.PRRSV 普通株與變異株鑒別診斷RT-PCR方法的建立與臨床應用［J］.中國獸醫(yī)學報，2012（3）：367-370.

［17］李和平，吳發(fā)興，李曉成，等.豬繁殖與呼吸綜合征的套式PCR 方法建立及應用［J］.華北農學報，2009（1）：115-118.

［18］Reicks D L，Mu N Oz-Zanzi C，Mengeling W，et al.Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in semen and serum of boars during the first six days after inoculation［J］.J Swine Health Product，2006，14（1）：35.

［19］Tian H，Wu J，Shang Y，et al.The development of a rapid SYBR one step real-time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Virol J，2010，7：90.

［20］Wernike K，Hoffmann B，Dauber M，et al.Detection and typing of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by multiplex real-time RT-PCR［J］.PloS one，2012，7（6）：e38251.

［21］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

［22］Zhang L，Liu Y B，Chen L，et al.Rapid and sensitive detection of PRRSV by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay［J］.Virol Sin，2011，26（4）：252-259.

［23］Qin C，Jian L，Xue-En F，et al.Rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification［J］.Intervirology，2009，52（2）：86-91.