趙 德，李 鵬，2，高鳳山＊，馮 磊，許崇波

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.河北省涿鹿縣醫(yī)院，河北涿鹿075600）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病［1-3］。從2010年以來，豬流行性腹瀉開始在全國流行，導致仔豬腹瀉，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失［4］。目前，傳統(tǒng)的豬流行性腹瀉疫苗已經(jīng)不能完全控制疫情的傳播和發(fā)生。在此情況下，研制新型的豬流行性腹瀉疫苗非常必要。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是一種易通過黏膜吸收的常在菌，適量的乳酸菌對維持腸道菌群平衡具有積極意義。NIZO公司近年來開發(fā)了乳酸乳球菌載體表達系統(tǒng)，在該載體上表達的外源基因很容易通過黏膜吸收；另外，該載體為食品級，不含有任何抗生素基因或其他有害成分［5-7］。利用該表達系統(tǒng)研制的疫苗，不僅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、無副作用的特點。

本研究以構建的豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗為免疫原接種小鼠，測定其體重增長、抗體產(chǎn)生及IFN-γ產(chǎn)生等，為豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗在豬體的免疫試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡的SPF級雌性Balb／c小鼠30只，平均體重25g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 乳酸乳球菌表達載體pNZ8149及乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ3900購自荷蘭NIZO研究所。乳鏈菌肽（Nisin）購自Sigma公司，PEDV抗體ELISA檢測試劑盒由哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力研究員課題組提供，小鼠IFN-γ購自凱基生物公司（南京），其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液的培養(yǎng) 豬流行性腹瀉病毒重組乳酸菌的培養(yǎng)參照文獻［8-9］進行。將在-80℃保存的PEDV S基因保護性抗原基因片段C-COE重組乳酸菌接種到含有乳糖的 M17液體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)過夜。表達菌培養(yǎng)后，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組乳酸菌穩(wěn)定性的檢測 按照乳酸菌堿裂解法提取豬流行性腹瀉病毒重組乳酸菌質粒，用SacⅠ和NcoⅠ雙酶切，以檢驗PEDV C-COE基因是否穩(wěn)定存在。同時將重組菌經(jīng)Nisin誘導，SDSPAGE檢測C-COE是否能正確表達。

1.2.3 免疫接種 將誘導后的PEDV重組乳酸菌在顯微鏡下計數(shù)，調整細胞數(shù)為1×109個／mL，然后用滅菌的PBS進行不同倍數(shù)稀釋。試驗小鼠分為6組，每組5只，從A～F組分別為空白對照組、2倍稀釋口服組、5倍稀釋口服組、10倍稀釋口服組、10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組。口服組每次每只小鼠空腹飲水6mL；間隔1周加強免疫，共免疫3次；注射組每只小鼠每次皮下注射0.2mL，間隔1周進行加強免疫，共免疫3次。

1.2.4 體重檢測 各組小鼠免疫前即第5周稱量1次，免疫后即第8周再稱量1次。比較各組小鼠體重增長情況。

1.2.5 PEDV特異性抗體檢測 最后一次免疫2周后對各組小鼠采血，分離血清，每組小鼠血清等比例混和，作為檢測樣品，然后用PEDV ELISA檢測試劑盒進行檢測，比較各組小鼠產(chǎn)生PEDV特異性抗體情況，以衡量疫苗刺激產(chǎn)生的體液免疫情況。測定時，每個樣品3個重復。

1.2.6 血清IFN-γ的測定 同1.2.5采血分離血清，每組小鼠血清等比例混和后，按照Mouse IFN-γ ELISA kit操作說明檢測每組小鼠血清IFN-γ含量，以衡量乳酸菌疫苗細胞免疫的效果。每個樣品測定時進行3個重復。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計學分析采用單側的t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 PEDV重組乳酸菌穩(wěn)定性檢測

利用SacⅠ和NcoⅠ的雙酶切后，除載體帶（2 591bp）外，得到一條大約530bp的插入片段，與目的基因大小相符，說明目的基因在重組表達載體穩(wěn)定存在（圖1A）；SDS-PAGE電泳檢測顯示，目的基因在重組菌中成功表達，大小約為20ku，與預期的大小一致（圖1B）。

2.2 體重增長情況

圖1 PEDV重組乳酸菌質粒穩(wěn)定性及表達鑒定Fig.1 Identification of stability and the expression of PEDV recombinant Lactococcus plasmid

免疫前后，共進行了2次體重測定，結果顯示各組之間體重增長的差異不顯著，其中10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組平均體重略高于對照組和其他試驗組，但統(tǒng)計學顯示組間差異不顯著（P＞0.05）。其余對照組、2倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組體重增長均等同于對照組（圖2）。

2.3 ELISA測定PEDV特異性抗體

口服組的PEDV抗體明顯的高于注射組，其中10倍稀釋口服組小鼠刺激產(chǎn)生的抗體水平最高，其次為2倍稀釋口服組。口服組小鼠的抗體水平均均顯著高于注射組（P＜0.05）（圖3）。

圖2 小鼠體重增長比較Fig.2 Comparison of weight gain among different groups of mice

圖3 ELISA檢測PEDV抗體Fig.3 Detection of PEDV antibodies by ELISA

2.4 小鼠IFN-γ測定結果

根據(jù)標準曲線，計算出各組小鼠血清中IFN-γ的含量，結果顯示5倍稀釋口服組和10倍稀釋口服組小鼠血清中IFN-γ整體水平不僅高于對照組，同時也高于注射組，與ELISA檢測PEDV特異性抗體試驗中的結果基本一致，而且，這4個試驗組小鼠血清中IFN-γ整體水平與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。2倍稀釋口服組的抗體含量較少，并低于對照組（圖4）。

3 討論

目前關于預防豬流行性腹瀉的疫苗還僅限于傳統(tǒng)的滅活疫苗，雖然對豬流行性腹瀉的傳播有一定的作用，但對于人類和動物而言，滅活疫苗中所含有的氫氧化鋁佐劑等都會對宿主細胞造成一定的損害。本研究在前期工作中構建了PEDV乳酸菌疫苗，該疫苗采用乳酸乳球菌表達載體來裝載PEDV的免疫保護性抗原S（C-COE）基因，并轉化入缺失乳糖表達基因的乳酸乳球菌，構建重組菌，該重組菌的篩選不需要抗生素，也不含有任何對宿主細胞有害的因素，屬于生物安全級的疫苗［10］。而且，乳酸菌能適應腸道環(huán)境，是腸道內的一種常在菌。乳酸菌易于通過腸道吸收，有利于產(chǎn)生黏膜免疫，這正好符合PEDV通過腸道感染并刺激產(chǎn)生黏膜免疫的特點［11-12］?？梢酝茰y，理論上通過口服這種疫苗產(chǎn)生的免疫效果要好于其他途徑，因此在試驗中我們設計了口服與注射兩種途徑。但作為口服疫苗，乳酸菌在腸道內是否越多越好，是否會影響其他菌群的平衡，進而影響動物的生長發(fā)育，也是本次試驗需要探討的問題。為此，在本試驗中，我們又設計了不同稀釋倍數(shù)的乳酸菌口服免疫小鼠，從生長發(fā)育及刺激產(chǎn)生的抗體等多個方面考察該乳酸菌疫苗的免疫效果。

圖4 小鼠血清中IFN-γ的含量測定Fig.4 Detection of the content of IFN-γ in sera of different groups of mice

通過測定免疫前后各組小鼠的體重，并比較各組小鼠的體重增長變化，發(fā)現(xiàn)各組間體重增長差異不顯著，對照組與2倍稀釋口服組、10倍稀釋口服組小鼠的平均體重增長一致，只是10倍稀釋注射組和100倍稀釋注射組小鼠的平均體重增略高于其他組，其原因目前不清楚，但組間差異不顯著。整體結果顯示，口服乳酸菌疫苗不會影響小鼠的生長發(fā)育。

免疫后，經(jīng)過ELISA檢測PEDV的特異性抗體，發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠產(chǎn)生的PEDV抗體均顯著高于對照組（P＜0.05），而且口服組小鼠的抗體水平均高于注射組（P＜0.05），其中10倍稀釋口服組產(chǎn)生的抗體水平最高。該試驗結果說明，該PEDV乳酸菌載體疫苗確實能夠刺激產(chǎn)生PEDV特異性抗體，而且通過口服即黏膜吸收比注射即皮下吸收更容易產(chǎn)生高水平的抗體。因此，通過該試驗進一步證實，乳酸菌載體疫苗確實更適宜于口服免疫，而且能夠刺激產(chǎn)生體液免疫。

本研究結果顯示，PEDV乳酸菌載體疫苗不僅能夠刺激機體產(chǎn)生體液免疫，而且還能刺激產(chǎn)生一定的細胞免疫另外，課題組嘗試了用PEDV強毒攻毒小鼠，檢測免疫保護率，但由于目前PEDV強毒對小鼠沒有致病性，所以無法測定免疫保護率。如果全面評價該疫苗的免疫保護率，下一步需要從本動物著手進一步研究該疫苗的免疫效果。

以上試驗結果基本說明該PEDV乳酸菌載體疫苗能夠刺激模式動物小鼠產(chǎn)生PEDV特異性抗體，而且能產(chǎn)生一定程度的細胞免疫。相關的數(shù)據(jù)可以提供以豬作為試驗動物后，開展進一步的臨床研究。

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